脂质体常用的制备方法包括薄膜分散法、逆相蒸发法、溶剂注入法、硫酸铵梯度法等［７－８］，采用乙醇注入法结合硫酸铵梯度法制备的盐酸多柔比星脂质体与市售的Doxil具有相似的处方，因此本研究拟通过对比研究两者体外的理化特性，为该制剂的仿制开发、进一步产业化及临床应用提供研究基础。

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材料

ＦＡ２５ 高速剪切仪（弗鲁克公司）；Nano-Zs90 纳米粒度及Ｚｅｔａ电位分析仪（英国马尔文有限公司）；AH－2020挤出器（ＡＴＳ）；ＸＳ２０４电子天平（METTLER　TOLEDO）；ＭＥ５００２Ｔ／０２电子天平（ＭＥＴＴＬＥＲ）；ＤＦ—１０１Ｓ加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器）；ＳＷ２２恒温水浴振荡槽（Ｊｕｌｎｂｏ）；AVANTI JXN－26离心机（Beckman　Culter.．ｉｎｃ，离心半径１０．８２　ｃｍ）；色谱柱（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ－ＯＳＤ－ＳＰ－Ｃ１８（４．６　ｍｍ×１５０　ｍｍ，５　ｕｍ）。１．２　试药　Doxil（JANSSEN　RES 　AND　DEV，批号HZZT500，规格２０ｍｇ／１０ｍＬ）；盐酸多柔比星原料药（ＯＬＯＮ，批号16004GS57F）；氢化豆磷脂酰胆碱（ＨＳＰＣ）（ｌｉｐｏｉｄ，批号525600-216160-17-01）；培化磷脂酰乙醇胺（MPEG2000-DSPE）（ｌｉｐｏｉｄ，批号5880200-2160076-01）；胆固醇（dishman, batch 批号 116CCG001）；硫酸铵（默克， 批号AM08971616）；氯化铵（天津市大茂化学试剂厂，批号201710008）；Ｌ－组氨酸（默克， 批号K48246635）；氯化钠（江苏省勤奋药业有限公司，批号２０１８０８１９）；乙醇为药用级、其他均为分析纯。

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方法与结果

２．１　盐酸多柔比星脂质体的制备　

采用乙醇注入法结合硫酸铵梯度法制备盐酸多柔比星脂质体［９］。将９５８　ｍｇ　ＨＳＰＣ、３１９　ｍｇ　MPEG2000-DSPE和３１９ｍｇ胆固醇加入适量无水乙醇中充分溶解形成类脂溶液，在水浴６０℃、１３　０００　ｒ·ｍｉｎ

－１持续高速剪切下将上述类脂溶液直接注入至硫酸铵溶液（２５０ｍｍｏｌ·Ｌ －１）中，剪切１５　ｍｉｎ，得空白脂质体初品；再用挤出器过膜挤出３次得空白脂质体混悬液。然后用蔗糖－组氨酸－盐酸缓冲液（盐酸溶液调节至ｐＨ６．５）超滤去除空白脂质体外水相的硫酸铵，最后加入盐酸多柔比星溶液，混匀，６５℃水浴振荡槽中孵育６０　ｍｉｎ，即得盐酸多柔比星脂质体混悬液，除菌过滤后４℃保存备用。

２．２　盐酸多柔比星体外含量测定方法的建立

２．２．１　色谱条件　

色谱柱：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ－ＯＳＤ－ＳＰ－Ｃ１８（４．６　ｍｍ×１５０　ｍｍ，５μｍ）；流动相：０．２８８％十二烷基硫酸钠溶液－甲醇－乙腈（４７∶６∶４７）；检测波长２５４ｎｍ；体积流量１．０ｍＬ·ｍｉｎ －１；柱温３０℃；进样体积２０μＬ。

２．２．２　专属性试验

精密移取对照品溶液、供试品溶液和空白脂质体溶液，按“２．２．１”项下色谱条件进行分析，结果如图１。空白脂质体溶液与供试品和对照品在相同保留时间无色谱峰，且峰型稳定，辅料和溶剂对其测定无干扰。说明本方法测定专属性高。

２．２．３　线性关系考察　

精密量取盐酸多柔比星对照品适量配制成０．１　ｍｇ·ｍＬ －１的标准贮备液，精密移取一定量贮备液分别配制浓度为１４、１６、２０、２４、２６μｇ·ｍＬ－１系列标准溶液，按“２．２．１”项下色谱条件进样，以峰面积Ａ 对浓度Ｃ（μｇ·ｍＬ－１）进行线性回归，得回归方程为：Ａ＝５５　９４０ｃ＋３０　０９７（Ｒ２＝０．９９７），结果表明在盐酸多柔比星１４～２６μｇ·ｍＬ －１范围内，与峰面积呈良好的线性关系。

２．２．４　精密度试验　

精密移取０．１　ｍｇ·ｍＬ－１的盐酸多柔比星标准贮备液，连续进样６次，按“２．２．１”项下色谱条件测定盐酸多柔比星峰面积，ＲＳＤ 为０．３％，表明此方法精密度良好。

２．２．５　回收率试验　

分别精密移取盐酸多柔比星对照品溶液４、５、６　ｍＬ，各加入１　ｍＬ空白脂质体配制成质量浓度分别为０．０１６ 、０．０２ 、０．０２　４　ｍｇ·ｍＬ －１的低、中、高浓度溶液，每个浓度平行配制３份，按“２．２．１”项下色谱条件进样。结果平均回收率分别为９８．５％，９９．５％，９８．８％，ＲＳＤ为０．５％。

２．３　盐酸多柔比星脂质体包封率的测定　

采用超速离心法测定盐酸多柔比星脂质体的包封率［１０］。准确移取盐酸多柔比星脂质体１　ｍＬ至超速离心管中，放入高速离心机２００　０００　ｒ·ｍｉｎ －１离心３０　ｍｉｎ，移取上层清液加生理盐水定容至５　ｍＬ（Ｗ 游离）；另取１　ｍＬ盐酸多柔比星脂质体用甲醇定容至１０　ｍＬ摇匀（Ｗ 总），采用ＨＰＬＣ法测定游离盐酸多柔比星含量和脂质体中盐酸多柔比星总量，计算盐酸多柔比星脂质体的包封率（ＥＥ）：

Ｗ 总、Ｗ 游离分别代表脂质体溶液中盐酸多柔比星脂质体的总量、游离盐酸多柔比星脂质体的量。

２．４　制盐酸多柔比星脂质体制备工艺优化

在单因素考察制备过程中高速剪切速率（ｒ·ｍｉｎ －１）、挤出次数、载药孵育温度（℃）、载药孵育时间（ｍｉｎ）等因素的基础上，选择对脂质体包封率影响显著的４个因素即高速剪切速率（ｒ·ｍｉｎ －１）（Ａ）、挤出次数（Ｂ）、载药孵育温度（℃）（Ｃ）、载药孵育时间（ｍｉｎ）（Ｄ）进行工艺优化，采用正交试验表Ｌ９（３４）设计正交试验方案，以包封率为评价指标对脂质体的制备工艺条件进行优化，因素水平表及试验结果表见表１，表２，方差分析结果见表３。由表２结果可知，各因素对包封率的影响顺序依次为Ａ＞Ｃ＞Ｄ＞Ｂ，由表３方差分析结果表明高速剪切速率对包封率有显著影响，最佳制备工艺为Ａ２Ｂ２Ｃ３Ｄ３，即为高速剪切速率为１３　０００　ｒ·ｍｉｎ －１；挤出次数３次；孵育时间为６０ｍｉｎ；孵育温度６５℃。

２．５　脂质体理化特性指标测定

２．５．１　形态　

取上述最优工艺制备盐酸多柔比星脂质体样品和Ｄｏｘｉｌ适量，在冷冻电镜下观察其形态结果显示自制盐酸多柔比星脂质体和Ｄｏｘｉｌ均外观圆整，多为椭圆形单室脂质体，大小分布均一，无明显差异。见图２和图３。

２．５．２　粒径及Ｚｅｔａ电位

采用纳米粒度及Ｚｅｔａ电位仪测定脂质体平均粒径和Ｚｅｔａ电位。脂质体样品和Ｄｏｘｉｌ用生理盐水稀释２００倍后放入样品池测定粒径。测得平均粒径分别为（９０．８１±０．５８）ｎｍ（ｎ＝３）和（８９．０５±０．６６）（ｎ＝３）及ＰＤＩ分别为０．０６１（ｎ＝３）和０．０５６（ｎ＝３）；ＲＳＤ 为０．６４％和０．９２％且峰形为单峰，说明脂质体粒径分布均匀；另取脂质体样品和Ｄｏｘｉｌ适量用纯化水稀释２００倍后放入样品池测定Ｚｅｔａ电位，结果Ｚｅｔａ电位分别为（－４１．９±１．８）ｍＶ（ｎ＝３）和（－４４．９±４．２）ｍＶ（ｎ＝３）；ＲＳＤ为５．１７％和１１．６％；该脂质体表面带负电荷，一般当其绝对值大于－３０　ｍＶ时，由于表面富有净电荷，彼此间存在较强的静电排斥力稳定性增强，因此两者稳定性较好［１１］。见图４，图５。

２．５．３　包封率　

按上述“２．３”项下方法测定包封率，结果自制脂质体和Ｄｏｘｉｌ的包封率分别为９８．０％和９７．９％，ＲＳＤ为０．３７％和０．３４％，两者测得包封率大于９５％符合２０１５年版《中华人民共和国药典》对脂质体包封率的要求。

２．５．４　相变温度　

取适量自制脂质体和Ｄｏｘｉｌ配制成浓度约为１５　ｍｇ·ｍＬ －１并稀释４０倍测定。２５～９５℃扫描，扫描速度为１℃·ｍｉｎ －１。结果显示在５２～５８℃和７０～７５℃相变明显，且两者相变温度范围比较一致。见图６。

２．６　体外释放　

采用加速的方法测定脂质体的体外释放［１２］。以２．０ｍｏｌ·Ｌ －１氯化铵溶液的０．２　ｍｏｌ·Ｌ －１组氨酸溶液为释放介质，分别精密量取３　ｍＬ自制盐酸多柔比星脂质体和ＤＯＸＩＬ与１　ｍＬ释放介质混合，充分混匀后取０．５　ｍＬ至试管中，（５２±１）℃水浴中放置，分别于０、０．５、１、３、６　ｈ取出并立即置冰水浴中冷却，按照测“２．３”包封率项下方法测定和计算经释放后的包封率，并按下式计算盐酸多柔比星脂质体的体外释放率。结果见图７。　从图可以得知，与Ｄｏｘｉｌ相比，３　ｈ累积释放率大于７０％，自制的盐酸多柔比星脂质体释放无明显差异，可见自制的盐酸多柔比星脂质体和Ｄｏｘｉｌ均具有一定的缓释作用。

２．７　稳定性试验　

取最优制备工艺制备的盐酸多柔比星脂质体和Ｄｏｘｉｌ在２～８℃条件下放置１、２、３个月，观察脂质体外观形状及测定其平均粒径及粒度分布、Ｚｅｔａ电位及包封率的变化情况。结果显示３个月内，脂质体澄清度及颜色无明显变化，两者上述各项指标无明显变化，表明该脂质体工艺较为稳定，重复性好。

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讨论

本实验采用乙醇注入法和硫酸铵梯度法制备的盐酸多柔比星脂质体脂质体为椭圆形，平均粒径约９０　ｎｍ，分散较为均匀，包封率高，稳定性好。乙醇注入法制得的空白脂质体粒径较小且分布较均匀为后续挤出工艺提供了良好的基础，同时工艺稳定可控也实现了其线性放大，而挤出工艺简单可控且产业化设备比较成熟，更有利于产业化。杨红艳等［１３］曾采用乙醇注入法制得包封率高的盐酸莫西沙星脂质体。

采用硫酸铵梯度法制备盐酸多柔比星脂质体则因为弱酸水溶性盐酸多柔比星可与硫酸铵盐缓冲液形成稳定的胶态沉淀从而提高盐酸多柔比星脂质体的包封率和稳定性。常用的有效分离脂质体和游离药物的方法包括葡聚糖凝胶柱色谱法、透析法和超速离心法等［１４］，本实验采用超速离心法，分离效率高，但离心速度及时间可能会造成药物泄露和破坏［１５］，因此仍需继续优化方法。体外释放可更深入反映产品内在质量属性与参比制剂是否一致，结果表明两者释放行为无明显差异，因药物包封在脂质体内部若释放出来须穿过脂质双层屏障从而具有一定的缓释作用。

盐酸多柔比星脂质体目前中国药企开发的此产品未被美国ＦＤＡ审批通过，也未在美国上市；国内虽有几家药企开发的此产品已上市，但尚未进行一致性评价研究，当前国家政策鼓励及ＦＤＡ 更新了此产品仿制开发的指导原则，因此仿制开发安全、有效、质量可控的此产品及在降低患者经济负担等方面具有重要的现实意义与市场意义，本实验通过自制脂质体制剂与参比制剂Ｄｏｘｉｌ体外质量指标对比，结果无明显差异，初步表明自制脂质体体外质量良好，以期未来自制脂质体能达到临床等效和实现产业化，而其产业化的实现对最终实现国内高端复杂注射剂走出国门具有重要的意义。

参考文献

详见 中国医院药学杂志 2020年月 第40卷第8期

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