第一作者：徐丹、周江涛

通讯作者：周江涛、Raffaele Mezzenga

通讯单位：苏黎世联邦理工学院

论文DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-023-42486-x

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该论文着重归纳总结了Raffaele Mezzenga团队在通过多种体外和体内技术来表征β-乳球蛋白和溶菌酶淀粉样原纤维的胃肠道消化过程，这些广泛的体外和体内研究共同表明，消化的食物淀粉样纤维与消化相应天然单体获得的多肽同样安全，表明食物蛋白淀粉样蛋白纤维是人类营养的潜在成分。

背景介绍

源于食品类蛋白的淀粉样蛋白纤维，包括牛奶 β-乳球蛋白、鸡蛋清溶菌酶、卵白蛋白和燕麦蛋白等，由于其卓越的理化和力学特性及生物相容性，已被证明可用于多种卓越功能的生物材料，生物医学，环境科学，材料科学和纳米技术等领域(1, 2)。同时在食品和营养健康学领域，食品蛋白的淀粉样蛋白纤维与天然蛋白单体相比也有优越的的技术功能及递送营养物质优势(3, 4)，从而越来越受到重视。但是由于对这种食品蛋白变性形式，即聚集成淀粉样原纤维，特征是具有高度有序的交叉β结构与破坏性神经退行性疾病的病理性淀粉样原纤维类似，人们对食品蛋白淀粉样蛋白的安全性有所担忧。虽然人类从石器时代起就开始食用乳制品，蛋类和谷类，除了极少数人群出现过敏性外，人们并不担心这些蛋白质的天然形式可能具有毒性。近年来，对淀粉样蛋白聚集的日益深入的了解表明，这些蛋白质纳米原纤维不仅限于病理学，而且原纤维化倾向可能构成许多现有蛋白质的通用特性。但是人们对食品蛋白淀粉样原纤维消化过程和广泛食用的安全性仍缺乏足够的了解，聚集蛋白的淀粉样蛋白状态相关的安全问题担忧依然阻止食品淀粉样原纤维在食品和营养健康中使用。

研究出发点

该团队报告了通过模拟体外胃肠道消化，与天然 β-lg 蛋白相比，对 β-乳球蛋白 (β-lg) 淀粉样原纤维的生物学命运进行的全面研究（图 1）。 这种源自牛奶的 β-lg 蛋白是对淀粉样蛋白形成研究最深入的食物蛋白之一，因此被选为本次消化研究的主要焦点。该团队首先用 SDS-PAGE 和ELISA跟踪 β-Ig 单体和淀粉样原纤维的动态蛋白水解消化。结果表明，β-Ig 淀粉样蛋白在胃消化后显着降解，并可在随后的肠道消化中分解，产生未折叠的寡肽，与体外消化的 β-Ig 单体的产物无法区分。 对溶菌酶淀粉样蛋白的消化过程研究不仅表明残留的消化肽是未折叠的寡肽。

为了进一步确定消化的 β-Ig 单体和淀粉样蛋白的组成，首先在线性模式检测下进行基质辅助激光解吸/电离质谱 (MALDI-MS)。如图2a，天然β-lg单体的光谱显示出三个主要主峰在胃消化后，除了部分消化的低于 5 kDa 的多肽外，该团队再次观察到剩余的 β-Ig 单体的这三个峰。 在肠道消化后，随着主要 β-Ig 单体峰的消失，分子量分布向小于 5 kDa 的种类转移，留下大部分消化的 1-2 kDa 寡肽，对应约 10-20 个氨基酸。相比之下，β-lg淀粉样蛋白纤维在胃消化后的淀粉样蛋白表现出四个小于4 kDa的主峰，随后肠道消化产生大量分子量低于5 kDa、以1-2 kDa为主的多肽。MALDI-MS谱显示这些β-Ig单体和原纤维的体外消化后的多肽的分子量约为1-2 kDa，并且β-Ig单体和纤维两者的体外消化中及消化后观察到大量同源多肽。

为了评估体外消化的淀粉样蛋白的生物相容性，该团队首先表征了它们对两种类型的人肠道细胞系（癌细胞系，Caco2；人结肠上皮细胞，HCEC）活力的影响。在比较所有浓度的 Caco2 和 HCEC 细胞中暴露于消化的单体与消化的原纤维后，发现细胞活力没有发现显着差异。β-lg/溶菌酶原纤维如上所述在体外消化，然后暴露于两种不同类型的人上皮细胞系，其行为基本上与其消化的单体对应物相同，即它们没有可检测到的细胞毒性，并且 与不含蛋白质的相同培养物相比，细胞的活力增加，表明它们被分解为具有生物相容性和营养性多肽。

为了检查喂食淀粉样蛋白纤维对线虫的毒性作用，该团队评估了线虫在衰老过程中的活动性（即游泳率）。 实验结果没有观察到单体、原纤维或消化原纤维对其身体活动有任何不利影响，相反，β-lg纤维和溶菌酶纤维延长了秀丽隐杆线虫衰老过程中的健康寿命。该团队得出结论，原纤维影响了秀丽隐杆线虫的新陈代谢，从而延长了健康寿命。当用 β-lg 和溶菌酶纤维喂养线虫时，观察到较高的相对运动性和改善的健康状况。

该团队对小鼠体内消化的食品蛋白淀粉样原纤维的消化过程进行 LC-MS/MS 分析和荧光标记监测，同时为了排除降解的原纤维通过胃肠道上皮吸收以及可能靶向其他器官，对长期服用β-lg/溶菌酶淀粉样原纤维诱导小鼠组织进行分析。小鼠实验结果表明，β-Ig和溶菌酶原纤维可以被消化成与其单体相同的寡肽，并且任何未吸收的原纤维消化寡肽不会进入血液，而是进一步代谢并与粪便一起排出体外。  因此，在小鼠血浆中没有检测到来自淀粉样原纤维的肽。 此外，在小鼠中没有发现长期摄入β-lg/溶菌酶原纤维诱导淀粉样斑块形成对健康产生影响，从而排除了交叉播种机制。

总结与展望

综上，该团队应用多种方法首先通过体外胃肠道消化来阐明 β-lg 和溶菌酶淀粉样原纤维的消化过程，然后使用两种动物模型评估潜在的体内毒性，在两种情况下都使用β-lg 和溶菌酶单体作为对照。SDS-PAGE和ELISA测量表明β-Ig淀粉样蛋白在胃消化后显着降解并在肠消化后完全降解。AFM分析表明淀粉样蛋白原纤维可以在 INFOGEST方法规范范围内的酶和淀粉样蛋白比例下被完全消化。 MALDI-MS谱显示这些消化的多肽的分子量约为1-2 kDa，并且在β-Ig单体和原纤维的体外消化中观察到同源多肽系列。体内结果表明，未发现β-Ig/溶菌酶原纤维降解产物对淀粉样蛋白有毒性或对健康产生影响，没有交叉进入小鼠的血流，并且在polyQ35线虫突变体和小鼠中没有交叉播种事件。

这些广泛的体外和体内研究共同表明，消化的食物淀粉样蛋白纤维与消化相应天然单体获得的多肽和蛋白同样安全，表明食物淀粉样蛋白原纤维是人类营养的潜在成分。且食物淀粉样蛋白纤维应被认为是可供人类食用的安全（GRAS），尽管最终的结论只能留给相关监管机构。相信这些结论为食品蛋白淀粉样原纤维有前途在未来食品科学及营养健康学领域的诸多应用铺平道路。

参考文献

1. T. P. J. Knowles, R. Mezzenga, Amyloid Fibrils as Building Blocks for Natural and Artificial Functional Materials. Adv. Mater. 28, 6546–6561 (2016).2. P. Chun Ke, R. Zhou, L. C. Serpell, R. Riek, T. P. J. Knowles, H. A. Lashuel, E. Gazit, I. W. Hamley, T. P. Davis, M. Fändrich, D. Erik Otzen, M. R. Chapman, C. M. Dobson, D. S. Eisenberg, R. Mezzenga, Half a century of amyloids: past, present and future. Chemical Society Reviews 49, 5473–5509 (2020).3. M. Nikbakht Nasrabadi, A. Sedaghat Doost, R. Mezzenga, Modification approaches of plant-based proteins to improve their techno-functionality and use in food products. Food Hydrocolloids 118, 106789 (2021).4. Y. Shen, L. Posavec, S. Bolisetty, F. M. Hilty, G. Nyström, J. Kohlbrecher, M. Hilbe, A. Rossi, J. Baumgartner, M. B. Zimmermann, R. Mezzenga, Amyloid fibril systems reduce, stabilize and deliver bioavailable nanosized iron. Nature Nanotech 12, 642–647 (2017).

课题组介绍

瑞士苏黎世联邦理工学院Raffaele Mezzenga 于2001年在洛桑联邦理工学院(EPFL)获得博士学位，并在加州大学圣塔芭芭拉分校(UCSB Santa Barbara) 获得博士后学位，随后于2003年加入洛桑雀巢研究中心。2005年，他被弗里堡大学聘为物理学副教授，随后于2009年加入苏黎世联邦理工学院担任正教授。他的研究重点是对软凝聚态物质自组装过程的基本理解。他的工作获得了多项国际知名奖项的认可，例如生物大分子/大分子青年研究者奖（2013年，美国化学会）、狄龙奖章（2011年，美国物理学会）和青年科学家研究奖（2011年，美国石油化学家）社会）。周江涛于 20020年在洛桑联邦理工学院 (EPFL) 获得博士学位，随后在苏黎世联邦理工学院（ETH）开始博士后研究并于2022年开始任高级研究员及讲师。他的研究专注于基于植物和动物蛋白及短肽的淀粉样蛋白聚集物，包括形成机理以及它们在食品学、营养健康学、生物材料科学和环境学上的应用。他的研究及成果获得过国家优秀自费留学生奖（2021）和EPFL Distinction荣誉博士学位奖（2020）等。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-42486-x