NF-κB是一种多效性转录因子，几乎存在于所有细胞类型中，并参与许多生物学过程，例如炎症，免疫，分化，细胞生长，肿瘤发生和凋亡。

   在哺乳动物中，NF-κB 家族由是由含有Rel 样结构域的五个相关的转录因子组成：P50、P52、RelA (p65)、c-Rel 和 RelB。

   NF-κB受翻译后修饰和亚细胞区室化的各种机制以及与其他辅因子或共抑制因子的相互作用的控制。

   未活化的NF-κB存在于细胞质中，与其抑制剂IκB结合；在传统激活途径中，IκB被IKK磷酸化后降解，释放的NF-κB异位至细胞核。并通过转录因子调节基因的表达。

   NF-κB的转录活性受翻译后修饰（例如p65-NF-κB亚基的磷酸化和乙酰化）的完全激活所调节。

   NF-κB p65存在多种翻译后修饰形式，例如磷酸化、泛素化和乙酰化等。

   NF-κB p65的翻译后修饰可能需要条件诱导，例如Calyculin A和TNF-a刺激细胞后，可检测到536位丝氨酸被磷酸化修     饰的NF-κB p65蛋白。

   由于NF-κB p65存在这些翻译后修饰，因此在WB实验时，这些翻译后修饰可能会影响NF-κB p65蛋白大小和条带数目。

   细胞核和细胞质中定位，通常在细胞核中定位，但其非活化形式也存在于胞质中。

   人（Q04206）：异构体1-4：59-60 kDa（预测）

   小鼠（Q04207）：异构体p65和p65 delta：59-60 kDa（预测）

   大鼠（Q7TQN4）：60 kDa（预测）

   磷酸化，泛素化，单甲基化，乙酰化

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   在WB实验时，由于NF-κB p65有多种翻译后修饰形式，因此可能会存在多条条带现象。

   在WB实验时，由于NF-κB p65有多种翻译后修饰形式，因此检测到的条带大小可能与预测大小不符。

   NF-κB p65的翻译后修饰可能需要条件诱导，因此条件诱导有助于解决信号弱或者无信号现象。

   使用新鲜制备的样本，防止冻存样本导致磷酸化修饰减弱。进行磷酸化修饰检测时，请先确认细胞内NF-κB p65总蛋白的含量。

   NF-κB p65蛋白有很多位点可能发生磷酸化修饰，请根据文献中诱导刺激后发生磷酸化修饰的确切位点，选择合适的抗体，推荐设置阳性对照。

   NF-kB p65: HeLa全细胞裂解液(ab150035)。

   NF-kB p65 (phospho S536): Calyculin A和TNF-alpha处理后的HeLa全细胞裂解液。

关键控制点

     在实验中除了需要注意常规问题外，还要特别关注以下关键控制点：

  样本制备

     添加复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。

     对于磷酸化修饰蛋白需添加足量磷酸酶抑制剂，防止靶标蛋白被去磷酸化。

     对于乙酰化修饰蛋白需添加足量去乙酰酶抑制剂，防止靶标蛋白被去乙酰化。

     整个样本制备过程中，保持样本置于冰上。

     通过Bradford分析、Lowry分析或BCA分析测定样本总蛋白浓度。

   电泳

     至少上样20μg总蛋白进行电泳。

   转膜

     建议转膜完成后使用丽春红染色，确定转膜是否成功。

     建议不要裁膜，保留全膜或至少 50-100kDa部分膜来孵育此抗体。