微生物降解是石油污染修复的主要方法之一，目前已有大量石油降解菌的分离研究报道[1, 2, 3]. 由于石油是一种复杂的碳氢混合物，水溶性较低，而通常单一菌株只对特定类型(如碳链长度、苯环数量等)烃类化合物具有降解效果，因而石油的微生物降解受到很大程度的限制[4,5]. 同时，由于石油降解是分步进行的，在石油降解过程中需要多种酶和微生物参与[6,7]，所以，在实际应用中，常采取多种混合菌降解石油[8, 9, 10, 11]. 微生物菌群通过协同作用，集合多种酶促体系促进酶解反应，能增加石油污染物质的降解水平[12]，Zhao等[13]构建由Rhizobiales sp.、Pseudomonas sp.、Brucella sp.、Bacillus sp.、Rhodococcus sp.、Microbacterium sp.和Roseomonas sp.组成的混合菌群能够去除71.4%的脂肪烃和36.0%的芳香烃； 张辉等[14]将芽胞杆菌(Bacillus sp.)和黄杆菌(Flavobacterium sp.)混合固定化后应用于地表水石油的降解，发现其效果明显优于单菌； 王志强等[15]将3株假单胞菌属、黄杆菌属和微球菌属组合在一起发现复合菌的降解率要高于3株菌的单一降解率； 赵硕伟等[16]将Rhodococcus sp.、Gordonia sp.和Pesudomonas sp.等比例组成复合菌群，其石油降解能力超过任何单一菌株，在5 d内能降解70.3%的石油； Hudcova等[17]比较了Bacillus cereus NDT4、Pseudomonas putida NDT1、Pseudomonas fluorescens NDT2 和 Achromobacter sp. NDT3这4株菌的混合菌及单菌对二硝基甲苯同分异构体的降解性能，结果表明混合菌比单菌的降解速度要快近50倍.

然而，微生物之间并非都是互惠共生关系，并不是所有的微生物组合都能促进污染物的降解，由于菌种之间存在着拮抗、竞争作用，微生物之间可能在一定程度上会对石油的降解起抑制作用，降低微生物组合的修复效果[18,19]，如何消除菌种间的抑制作用、构建出优势菌群是当前所要解决的一个主要问题之一. 目前研究已发现不同种属的石油降解菌株组合在一起能促进石油的降解，但微生物之间的相互关系却仍不清楚，其筛选和组合还是一个随机过程，特别是关于种间相互作用机制的认识还十分有限，虽然已有少量关于同种属微生物的研究报道，如Serebrennikova等[20]研究了固定化的两株红球菌属Rhodococcus ruber 和 Rhodococcus opacus在生物反应器中对石油烃的降解应用，Barsing等[21]筛选分离出矿化解磺化芳香胺的3株假单胞菌属(P. pseudoalcaligenes TJ21、 P. citronellolis TJ22 和P. testosterone TJ23)，通过构建混合菌群发现，三元混合菌效果要高于单菌和二元混合菌，其矿化效果高达90%，但是关于种间微生物对石油降解的相互作用机制仍不清楚，如何优化组合种间微生物有待进一步研究.

本研究从天津大港油田石油污染土壤和渤海海上钻井平台洗油污水中进行细菌分离富集，筛选出具有石油降解能力的菌株，通过细菌生理生化实验、16S rDNA序列分析对石油降解菌进行鉴定； 采用单因子变量法，对同菌属种间的石油降解菌进行排列组合构建石油降解微生物组，测定其石油降解效果，从而确定最优菌种组合，同时结合微生物基因系统进化树来分析探讨同菌属种间的相互作用，以加深对石油降解菌群的认识，以期为石油污染的生物修复提供理论依据. 1 材料与方法 1.1 样品的采集与石油测定

样品采集：本实验所用土壤和含油废水分别取自于大港油田某输油管漏油口和中国渤海某钻井平台洗油污水.

土壤含水率测定：重量法.

pH值测定：土壤用去CO2蒸馏水按1 ∶2.5比例稀释后用pH计法测定； 水样直接用pH计测定.

石油质量浓度测定：紫外分光光度法[22,23]. 用60～90石油醚溶解原油配制成0、1、2、4、6、8、10 mg ·L-1 质量浓度的原油标样，依据不同的吸收特性，分别测定烷烃和芳烃的最佳吸收波长(实验确定烷烃为227 nm，芳香烃为258 nm)，在最佳吸收波长下，制作烷烃和芳烃的标准吸光度曲线.

土样石油质量浓度测定：通过索氏提取法萃取土壤中石油烃，用紫外分光光度测定烷烃和芳烃的质量浓度.

水样石油质量浓度测定：称取80.00 mL水样至分液漏斗中，加入2.0 g NaCl和1 mL(1 ∶1)H2SO4，用60～90石油醚洗涤采样瓶并将洗液转至分液漏斗，充分振荡3 min，静置分层，将水相放入原采样瓶中； 在玻璃砂芯漏斗中内铺约1 cm左右厚度的脱脂棉，称取5.0 g无水Na2SO4放入脱脂棉上方，将萃取液滤入50 mL容量瓶中； 将采样瓶中的原水相重复萃取3次，萃取液滤入同一容量瓶中； 最后用15 mL石油醚洗涤漏斗，将洗液转移至容量瓶中、定容； 以石油醚为参比，测定样品中烷烃和芳烃的吸光度值，计算烷烃和芳烃的质量浓度.

培养基Ⅰ：NaNO3 2.0 g ·L-1，KH2PO4 1.0 g ·L-1，K2HPO4 ·3H2O 0.5 g ·L-1，NaCl 0.5 g ·L-1，MgSO4 ·7H2O 0.1 g ·L-1，CaCl2 0.01 g ·L-1，FeSO4 ·7H2O 0.01 g ·L-1，原油(取自大港油田)10.0 g ·L-1，pH 7.2～7.4，121℃灭菌20 min.

培养基Ⅱ：牛肉浸出膏 3.0 g ·L-1，蛋白胨 10.0 g ·L-1，NaCl 5.0 g ·L-1，琼脂 20.0 g ·L-1，原油(取自大港油田)5.0 g ·L-1，pH 7.2～7.4，121℃灭菌20 min.

降解菌富集：将石油污染土壤和污水分别用0.8%灭菌生理盐水按1 ∶10稀释、混合均匀，取10 mL稀释菌液加入90 mL培养基Ⅰ中，28℃、300 r ·min-1条件下培养7 d； 以10%接种含量加入新的培养基Ⅰ中循环接种培养3次进行富集培养.

降解菌纯化：将上述富集菌液用灭菌生理盐水稀释为10、100、1 000倍这3个梯度，分别取菌液1 mL于培养基Ⅱ中进行平板分离，37℃恒温培养. 待培养皿长出菌落后，根据形态、颜色等挑选典型菌落在培养基Ⅱ上划线纯化，重复3～4次，直至出现单菌落，将纯化后的单菌株接入液体培养基中扩大培养并保存菌种.

生理生化试验：对菌落的形态、颜色进行观察记录； 同时进行革兰氏染色和镜检，并对纯菌进行生理生化实验(甲基红、淀粉水解、葡萄糖氧化发酵、乳糖氧化发酵、硝酸盐还原、柠檬酸利用、明胶、V-P试验).

16S rDNA鉴定：使用DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen，USA)试剂盒提取菌株DNA，具体步骤参见试剂说明书，采用27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492R(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)引物扩增16S rDNA，所用试剂为Go Taq Master Mix(Promega，USA)，PCR步骤和程序采用Wang等[24]的方法. PCR产物送交华大基因北京公司进行DNA测序. 将基因序列在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行同源序列搜索，使用MEGA Version 5.0软件对基因序列进行系统发育分析和进化树的构建.

培养条件：将降解菌以20%接种含量加入150 mL原油培养基中，在30℃、300 r ·min-1振荡培养7 d，设置一组空白对照，每组实验设置3个平行.

降解率测定：参照1.1节中方法测定7 d后液体培养基中的残余烷烃和芳烃的质量浓度. 为了消除石油灭菌和自然光降解等所引起的误差，菌株对原油(烷烃和芳烃)的降解率以空白组为参照，降解率计算公式如下：

根据烷烃和芳烃降解率，选取4株芽胞杆菌根据排列组合(C24+C34+C44)构建11个微生物组，以20%总接菌含量(每种细菌具有相同的比重)进行降解实验，培养条件为：150 mL 5.0 g ·L-1原油培养基，30℃、300 r ·min-1恒温振荡培养7 d，设置一组空白对照，每组设置3个平行. 微生物组的石油降解率测定方法按照1.3节中所述方法进行，最后计算出微生物组烷烃和芳烃的降解率，使用方差分析比较数据间的差异. 2 结果与分析 2.1 菌株的分离鉴定及降解性能

大港油田石油污染土壤呈碱性(pH=8.1)，芳烃含量(以干土计)为(10.10±4.64)mg ·g-1，烷烃含量(以干土计)为(9.55±5.05)mg ·g-1； 石油废水呈酸性(pH=6.3)，其芳烃含量为(5.65±2.37) mg ·L-1，烷烃含量为(5.47+2.57) mg ·L-1. 本实验通过富集分离得到6株细菌，经显微镜形态观察和生理生化试验进行初步鉴定，其结果如表 1所示，从土壤中分离出的S1、S2、S3和S4是革兰氏阳性细菌，从废水中分离出的W1和W2是革兰氏阴性细菌.

细菌16S rDNA基因系统进化树(图 1)分析鉴定进一步表明，从土壤分离的4株菌(S1、S2、S3、S4)属于Firmicutes厚壁菌门中的Bacillus芽胞杆菌属，其同源性分别为100%、100%、97%和100%，从废水中分离的2株菌W1和W2分别属于Proteobacteria变形菌门中的Pseudomonas假单胞菌属和Ochrobactrum苍白杆菌属，其同源性分别为100%和99%.

分离菌株的7 d石油降解率如图 2所示，各细菌降解率具有显著的差异(P分链烷烃>单环芳烃>多环芳烃[2,25]. 此外，单菌石油降解结果还显示，从中海油污水中分离出的Pseudomonas假单胞菌属(W1)和Ochrobactrum苍白杆菌属(W2)对大港油田石油的降解率低于从大港油田土壤中分离出的Bacillus芽胞杆菌属S3和S4，这表明，从石油污染场地中筛选出的内源微生物对本油田石油的降解效果要优于外源物种.

实验从土壤中筛选出4株芽胞杆菌属菌株构建 11个微生物组进行石油降解，分析同菌属微生物之间对石油降解的相互作用，其降解率如图 3所示. 结果显示即使是同菌属间的微生物组合也具有极显著不同的石油降解率(P0.05)，其余均出现了极显著地降低(P