甜樱桃(Prunus avium L.)，又名迎庆果、樱珠、车厘子，属于蔷薇科李属樱桃亚属植物。作为我国北方上市最早的高档鲜食水果之一，甜樱桃营养丰富，果实中含有紫苏子醇等多种次生活性物质，对于预防各种慢性疾病及维持人体健康具有重要作用[1]。近年来，随着新疆种植业结构的调整，樱桃在新疆各地区引种栽培面积逐渐增加，新疆各大超市的本地甜樱桃比重越来越大。然而，由于樱桃果实肉软、皮薄、多汁，加上储运保鲜方式不当，果实采后腐烂率可高达50%[2]，造成巨大的经济损失。其中，由真菌侵染引起的果实腐烂可占甜樱桃采后损失的1/2以上，例如樱桃表面凹陷、破裂、出现水渍状斑点等。目前国内外对甜樱桃的保鲜机理研究多集中于预防田间种植的果树致病菌[3]以及控制樱桃果实采后生理变化[4]，而对引起樱桃采后腐烂的致病菌关注度相对较低。其中，已报道的樱桃致病菌多为丝状真菌，如链格孢菌(Alternaria sp.)[5]、镰刀菌(Fusarium sp.)[6]、地丝菌(Geotrichum sp.)、盘长孢菌(Gloeosporium sp.)、毛霉菌(Mucor sp.)[7]等。

本研究以石河子地区市售新疆产甜樱桃为研究对象，通过形态学与分子生物学相结合的方法，对甜樱桃果实采后病原菌进行了分离鉴定，明确了引起新疆甜樱桃腐烂的病原真菌主要来自毛霉属(Mucor)、镰刀菌属(Fusarium)和青霉属(Penicillium)，以期为新疆产甜樱桃的采后保鲜提供理论依据。

供试新疆甜樱桃产地为兵团第八师136团，样品于2017年2−4月购自新疆石河子市水果销售市场。

马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar，PDA)培养基(g/L)：马铃薯葡萄糖水(脱水干粉) 24.0，琼脂20.0，pH自然。

PCR引物，生工生物工程(上海)股份有限公司合成；DNA聚合酶Premix Taq™，宝生物(TaKaRa)工程(大连)有限公司；DNA胶回收试剂盒，北京全式金生物技术有限公司。

梯度热循环PCR扩增仪，SensoQuest公司；显微镜，徕卡公司；高速离心机，Thermo公司；紫外凝胶成像仪，Bio-Rad公司；标准型pH计，上海精密科学仪器有限公司；生化培养箱，常州诺基仪器有限公司。

病原真菌分离参考崔志婧等[8]方法。用接种针直接挑取甜樱桃果实感病组织，将其接种到PDA培养基上，25 ℃培养。表面消毒：切取距离甜樱桃果实病斑2 mm处的组织，先用70%的酒精浸泡30 s，迅速将酒精用无菌滤纸吸出，移入1%的次氯酸钠溶液浸泡1 min，再用无菌水清洗3次后用灭菌滤纸吸干组织块表面水分，植入PDA培养基中，25 ℃培养。当菌落直径生长至1 cm时，用接种针挑取不同菌丝尖端分别植入新的PDA培养基平皿内，继续培养。重复上述操作2−3次分出单一菌落即可作为纯化菌种移入试管低温保存备用。

接种用病原菌的制备、被接种甜樱桃果实的准备及有伤、无伤接种方法参考许玲等[9]方法。

选取在PDA培养基上继代培养2代后的新鲜菌株供试。用打孔器取直径5 mm的菌体接种。

选取健康无伤、大小一致的甜樱桃，用酒精棉球对甜樱桃果实表面进行擦拭消毒，再用无菌水清洗晾干。

有伤接种：用接种针在甜樱桃果实对称部位分别刺2个孔(孔深5 mm左右)，用无菌打孔器打取在PDA培养基活化好的待测菌株菌碟，接种至伤口处；无伤接种：另取完好甜樱桃果实直接接种。有伤接种和无伤接种均以接种相同直径的空白菌碟作为对照。将接种后的甜樱桃果实放入无菌干燥器内，25 ℃条件下饱和湿度放置7 d。有伤和无伤各接种4颗甜樱桃，每个甜樱桃上接种2个菌碟，进行3次重复。记录发病情况，通过致病性确认后的菌株进行再次分离，并与最初接种的纯化菌株进行比较。

将供试菌株接种于PDA平板上，置于25 ℃恒温培养箱培养，观察记录菌落特征，如颜色、形态、生长速度等。待其产孢后，使用显微镜观察产孢结构、分生孢子种类与形态。根据菌落特征、分生孢子梗、分生孢子及其他生物学特性与真菌鉴定手册[10]对比鉴定病原菌。

称取0.05 g在PDA培养基上生长7 d的待鉴定病原菌菌丝，参考刘少华等[11]的方法提取病原真菌基因组DNA，−20 ℃保存备用。

利用真菌rDNA-ITS通用引物ITS1 (5′-TCCG TAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′)进行扩增。PCR反应体系(20 μL)：PCR Mix (2×) 10 μL，引物ITS1和ITS4 (10 μmol/L)各0.5 μL，模板DNA (100 mg/L) 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 7 min。PCR扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，经胶回收试剂盒回收纯化，−20 ℃保存备用。

纯化PCR产物与pMD19-T载体连接后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果在NCBI的BLAST数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对，选取近缘种用ClustalX软件比对序列，再用MEGA 6.0软件构建系统发育树。

用无菌打孔器在预先培养(PDA培养基培养2 d)的菌落边缘打取直径5 mm的菌碟，再将菌碟转接至各皿PDA培养基中央。用十字交叉法每12 h测量一次菌落直径，连续测量6 d。每个菌株接种4皿，重复3次。

应用Origin 7.5分析处理数据并制图。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)结合t检验分析各组数据差异显著性。

新疆石河子产甜樱桃在贮藏过程中表现出的病害症状主要有两种：(1)果实组织初期呈水渍状斑点，中后期病斑迅速软腐、有大量汁液流出、造成果皮破损，逐渐病斑表面长出灰褐色分生孢子层，侵染性强(图 1B)；(2)果实发病组织表面有白色短绒毛状菌丝，发病初期有大量分生孢子，周围略呈水渍状，果实轻微凹陷，后期随白色菌落不断蔓延造成果实明显凹陷，但无水渍溢出，且果实表皮无破损(图 1C)。

从供试的市售感病石河子甜樱桃发病部位共分离纯化出40株丝状真菌。根据其培养性状和菌落特征可以将其初步划分为5种类型(表 1)。其中分离出的Ⅰ类丝状真菌最多(19株)，占总分离菌株的47.5%。将分离纯化的5类丝状真菌依照柯赫氏法则重新接种甜樱桃果实，从致病的甜樱桃果实病斑组织再次分离病原菌，在PDA培养基上纯化培养后，与最初的接种菌进行比较。结果显示有伤接种和无伤接种Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ 3类真菌均会在甜樱桃果实表面形成明显病斑，3类致病真菌的菌斑直径Ⅰ类 > Ⅱ类 > Ⅳ类(图 2)，表明Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ 3类真菌是造成甜樱桃果实腐坏的致病菌。其中，Ⅰ类丝状真菌菌丝附着处会造成严重的甜樱桃腐坏，使樱桃表皮破裂，果肉组织出现明显的水渍化，产生大量分生孢子，致病效果明显(图 3A)；Ⅱ类丝状真菌的白色菌落覆盖于樱桃表面，在菌落覆盖下方有甜樱桃组织的凹陷，造成果肉一定程度的水质化，致病性较强(图 3B)；Ⅳ类丝状真菌致病中心呈青色、外扩菌丝呈白色，菌丝对甜樱桃表皮的侵染性较强，造成果实轻微凹陷，果肉水质化程度不高(图 3C)。

PDA培养基上生长的XJC-01菌落为蓬松的绒毛状，菌丝较长，无隔、多核、分枝状，呈白色，无假根或匍匐菌丝(图 3D、G)；菌丝体上直接生出总状分枝的孢囊梗，各分枝顶端长着球形孢子囊，状似蒲公英(图 3J)；囊内产生大量椭圆形的孢囊孢子(4.0−5.0) μm×(2.5−4.0) μm (图 3K)。

XJC-02菌落表面白色，肉眼可观察到白色毡状菌丝，气生菌丝盘旋致密，菌丝较短，背面呈紫褐色，在PDA培养基中分泌淡紫色、褐色色素(图 3E、H)；该菌不易产孢，在PDA培养基上生长7 d产生少量小型分生孢子，卵圆形至椭圆形、透明、单胞(3.0−5.0) μm×(2.0−4.0) μm (图 3L)。

XJC-04菌丝为白色，菌落由白色逐渐变成青绿色，层状生长，直径增长较慢，菌层较厚(图 3F、I)；菌丝体顶端产生分生孢子梗，分生孢子梗形成多个分枝，分枝末端着生成串的分生孢子，形如扫帚(图 3M)；分生孢子呈圆形，有细胞核结构(1.5−3.5) μm×(1.5−3.5) μm (图 3N)。

3类致病真菌(XJC-01、XJC-02和XJC-04)菌碟在PDA培养基上生长速度差异显著。XJC-01菌落呈线性增长，培养3 d后菌落直径达到89.67 mm±1.53 mm，生长速度最快；XJC-02在培养第1天长势基本为0，从第2天起呈线性增长，在第6天达61.00 mm±1.00 mm，生长速度较快；XJC-04在培养的前4天菌落直径几乎不变(但大量产孢)，至第5天才缓慢增长，第6天时菌落直径仅有19.00 mm±0.87 mm (图 4)。

采用真菌rDNA-ITS序列通用引物(ITS1和ITS4)对新疆甜樱桃致病菌株XJC-01、XJC-02和XJC-04进行鉴定。以3株病原菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳后分别得到3条500−750 bp之间的清晰明亮的条带(图 5)。将获得的PCR产物测序后，分别得到614 bp的XJC-01 rDNA-ITS序列(GenBank登录号为MG273756)、558 bp的XJC-02 rDNA-ITS序列(GenBank登录号为MG273757)和586 bp的XJC-04 rDNA-ITS序列(GenBank登录号为MG273758)。XJC-01、XJC-02和XJC-04的rDNA-ITS序列经过BLASTn核酸序列比对，选取相似性最高的菌种rDNA-ITS序列，采用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发育树(图 6)。结果表明XJC-01与毛霉属的Mucor fragilis亲缘关系最近；XJC-02与镰刀菌属的Fusarium proliferatum及Fusarium fujikuroi的亲缘关系最近；XJC-04与青霉属的Penicillium camemberti及Penicillium oxalicum亲缘关系最近。结合病原真菌形态学特征和序列分析，将菌株XJC-01鉴定为易脆毛霉(Mucor fragilis)，XJC-02鉴定为镰刀菌(Fusarium sp.)，XJC-04鉴定为干酪青霉(Penicillium camemberti)。

甜樱桃属于呼吸非跃变型果实，由于果肉几乎不含淀粉类的碳水化合物，采后生理变化非常明显，低温环境下甜樱桃的货架期仅为7−14 d[12]，因此提高甜樱桃的采后品质和延长货架期具有重要的经济意义。本研究从新疆石河子地产甜樱桃腐烂的果肉中分离出5类丝状真菌，通过有伤/无伤两种方式将获得的丝状真菌重新接种健康甜樱桃果实进行鉴定，结果表明以XJC-01、XJC-02和XJC-04为代表的3类真菌是导致新疆石河子地产甜樱桃腐烂的病原菌。病原菌无伤接种染病率也达到100%，表明3种病原菌均具有较强的侵染能力。接种后病斑直径数据显示3种致病菌致病力的强弱依次为：XJC-01 > XJC-02 > XJC-04。结合病原菌形态学特征和真菌rDNA-ITS序列，初步将XJC-01鉴定为易脆毛霉(Mucor fragilis)，XJC-02鉴定为镰刀菌(Fusarium sp.)，XJC-04鉴定为干酪青霉(Penicillium camemberti)。

已有的研究报道表明，甜樱桃果实采后腐烂病原菌主要以丝状真菌为主，常见的采后真菌性病害主要有青霉病(Penicillium expansum)、灰霉病(Botrytis cinerea)、软腐病(Rhizopus sp.)、褐腐病(Monilinia fructicola)、绿腐病(Cladosporium herbarum)、交链孢霉腐病(Altemat alternata)等[13]，但不同产地甜樱桃果实致病菌种类存在一定的差异。比如，烟台地区大樱桃采后分离的采后病原真菌有6种：燕麦赤霉菌(Gibberella avenacea)、总状毛霉(Mucor racemosus)、三线镰刀菌(Fusarium tricinctum)、互生链格孢菌(Alternaria alternate)、奥桑青霉菌(Penicillium polonicum)和烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)[6]，而大连和河北的不同甜樱桃品种中分离出的4种致病菌分属链核盘菌属(Monilinia Honey)、桃炭疽盘长孢菌(Gloeosporium laeticalor Berk.)、链格孢属(Alternaria alternate (Fr.) Keissl.)和葡萄孢属(Botrytis cinerea Pers. ex Fr.)[7]。本研究主要对新疆石河子地产甜樱桃腐烂组织中的病原真菌进行了分离，并将3种致病菌分别鉴定为易脆毛霉(M. fragilis)、镰刀菌(Fusarium sp.)和干酪青霉(P. camemberti)。受到毛霉污染的食品包括豆类、乳制品、玉米、大麦、水果、蔬菜等，其中毛霉在乳制品和豆类中的检出率最高[14-15]；干酪青霉(P. camemberti)也是发酵乳制品中的常见微生物[16]，新疆是我国四大牧区之一，乳制品种类丰富多样，导致新疆石河子地产甜樱桃的致病真菌种类可能与本地区的畜牧微生态环境有一定的关系。此外，本研究还从石河子甜樱桃果实腐烂组织中分离获得了9株酵母菌，基于rDNA-ITS基因序列的鉴定结果显示，分离的酵母菌均为假丝酵母(Candida sp.)，而将分离获得的酵母菌重新接种健康的甜樱桃果实并未导致甜樱桃果实致病(此部分数据未显示)，表明假丝酵母并不是导致石河子甜樱桃腐烂的致病菌。然而，分离的假丝酵母菌与毛霉菌、镰刀菌和青霉菌等丝状真菌对甜樱桃果实是否存在复合侵染作用还有待进一步研究。

本研究明确了引起新疆石河子地区甜樱桃采后腐坏的致病真菌包括毛霉菌、镰刀菌和青霉菌，这将为控制地产甜樱桃采后腐坏、提出针对性的防腐贮藏手段提供借鉴和思路。已有研究发现热空气处理(44 ℃、114 min)不仅能够诱导甜樱桃果实的抗病性，还能降低贮藏期间青霉病的发病率和果实病斑直径的扩展[17]。此外，通过百里香精油和丁香精油熏蒸或直接接触处理，对侵染甜樱桃果实的毛霉菌也具有较好的抑制作用(抑制率均达100%)[18]。因此，结合现有广谱杀菌措施，针对石河子地产甜樱桃致病菌毛霉菌、镰刀菌和青霉菌筛选有效的选择性杀菌剂，可能为预防樱桃腐烂、延长石河子地产甜樱桃保鲜期和货架期提供有效措施。