实验四  质粒DNA的提取，纯化与鉴定

DNA体外重组技术

【实验原理】

是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法取得感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组分子转入受体细胞，并筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增，成为克隆。

【实验步骤】

1.分离或合成感兴趣的目的基因及载体---分

2.构建、改造作为载体的DNA------------切

3.目的基因与载体DNA在体外重组--------接

4.重组DNA引入受体细胞----------------转

5.阳性重组子的筛选、鉴定、扩增-------筛

【注意事项】

目的基因的获得：

1.从染色体DNA中直接分离

2.人工合成

3.由mRNA逆转录合成cDNA

4.从基因组文库中筛选目的基因

5.PCR获得

载体的选择：

1.能在宿主细胞中独立复制，并能携带重组DNA片段一同扩增；

2.有合适的限制性酶切位点便于进行克隆；

3.有一定的筛选标记，易于识别和筛选；

4.载体分子应尽量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制；

5.表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件；

6.生物安全性好。

质粒DNA的提取

【实验原理】

     质粒是细胞质中独立于染色体之外的能自主复制的遗传单位。基因工程中的质粒一般是指细菌质粒，它可以随着细菌的细胞分裂将自己的遗传特性稳定的遗传给后代细胞。质粒中除了复制、转录等相关的必需序列外，有一些DNA区段对于细菌来说并非必需序列，通过体外操作以目的基因取代这些非必需区段，这种改造的质粒就成为外源基因载体。按照质粒载体的用途和其外源DNA的遗传信息能否表达可分为中间克隆载体（如pMD18-T）和表达载体（如pET-X、pBI121等）。克隆载体所连接的的DNA片段一般没有启动子，因而不能转录，主要用于目的片段的大量制备。表达载体按照宿主的不同有各种各样的原核表达载体（如大肠杆菌）和真核表达载体（如酵母、动物和植物），目的基因在载体上有完整的启动子和终止子调控，可以在宿主细胞中转录并翻译成蛋白。  根据质粒在宿主细胞中复制调控机制的不同，可分为两类：一类是“松驰型”质粒，如pMB1/colE1复制子，其复制受到一种称为RNAII的分子正向调控，不需要任何质粒编码的蛋白质，完全依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质，因此即使在氨基酸饥饿或添加氯霉素等抗生素抑制蛋白质合成的条件下，其复制仍不停止，；二是“严紧型”质粒，如pSC101，其复制伴随着RepA蛋白的合成，因此一旦蛋白质合成受阻，其拷贝数就不能增加，即在宿主的“严紧”控制下复制。在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用的是“松驰型”质粒；但在某些特殊原因（如表达产物对细胞有毒性）下要求用严紧型质粒。

…… …… 余下全文