图三 检索该转录本相应外显子序列（CDS序列）

2、通过检索得到的组织表达量信息查找相应的组织细胞（图四），用于提取RNA,逆转录为cDNA备用。通过检索得到的CDS序列生成 .dna 文件，构建到 pUCm-T 载体上，并设计调取引物（图五）。

图四 根据表达量信息查找相应组织细胞（TM3）

图五 基因载体设计，并设计调取引物

3、将提取好的cDNA用调取引物进行两轮PCR扩增(STAR Max Mix高效扩增；Taq Mix加A尾扩增），并回收扩增产物。

4、将带有A尾的PCR产物与pUCm-T载体用T4 DLigase连接酶连接，将连接产物转化，挑单菌落测序（测序结果如下图，测序引物T7），Cited1(NM_001276466.1)基因调取完成。

1、在NCBI网站检索AKAP5(NM_133515)基因转录本信息（CDS序列、表达量，如下图）。

图一 AKAP5(NM_133515)-CDS序列信息

图二 该基因在组织中表达量信息 图二 该基因在组织中表达量信息

2、通过检索得到的组织表达量信息索要相应大鼠组织，用于提取RNA,逆转录为cDNA备用。通过检索得到的CDS序列生成 .dna 文件，构建到pcDNA3.1-3xFlag-C V1载体上，并设计调取引物（图三）。

图三 AKAP5(NM_133515)基因调取载体设计

5、将提取好的cDNA用调取引物进行两轮PCR扩增(STAR Max Mix调取引物高效扩增；STAR Max Mix重组引物高效扩增），并回收扩增产物。

6、将带有重组尾的PCR产物与pcDNA3.1-3xFlag-C V1载体用Sosoo连接酶连接，将连接产物转化，挑单菌落测序（项目进行中，暂无测序结果），Cited1(NM_001276466.1)基因调取完成。



1、前几个步骤信息检索与上述两个案例类似，不再赘述。

2、由于MAP1B(NM_005909)基因CDS序列过长（7407bp），因此在该基因内部设计两对调取引物，采用三段调取的方案，如图一。

图一 MAP1B(NM_005909)基因分段调取方案 图一 MAP1B(NM_005909)基因分段调取方案

3、将分段调取产物用Sosoo连接酶与载体重组链接，转化，测序，MAP1B(NM_005909)基因调取完成。

好，以上就是基因调取的三个实操案例啦，学会了吗？

本期的实验技术就讲解到这里，

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