原创内容，欢迎转载，转载请注明出处

主笔：于浩

1、荧光定量PCR的实验流程包括“RNA 提取 → 反转录 → 设计引物 → （预实验）→Q-PCR” 4个步骤，其中“RNA提取和反转录”的步骤请参考实验流程：“Trizol法提取总RNA+反转录”。本实验方案主要讲介绍后面3个实验步骤。

2、跟其他方案一样，本实验方案是一个“简易可行“的实验方案，大而全不是本方案的目的，本方法肯定有很多不精准的地方，但是不会出现原则性错误，本方案的目的让操作人员按照本流程能够做出来结果。

本实验方案只能够覆盖90%以上的qPCR实验需求，一些特殊的情况，比如说失踪无法获得合适的引物、一定要用ROX试剂、无内参对照等，需要自己从网上来查询相应方法。

3、本方案适用于于做某个基因在不同条件下表达的相对定量，不适合做绝对定量，也无法获得具体的拷贝数，对于具体需要多少重复，如何选择内参基因、哪个品牌的Mix更好用等复杂问题不进行讨论，想要了解这些复杂问题可以自行查阅文献。

1、用于qPCR的引物长度一般在20-25 bp，TM值一般在60℃左右（TM值很重要）。

2、扩增的目的片段长度建议在150-250 bp（通常80-300 bp均可，引物二聚体的长度为30-40 bp，因此目的片段长度过低无法跟引物二聚体区分）。

3、如果文献中有qPCR的引物报道可以直接采用文献中的引物序列，也可以自己设计。常用的引物设计软件有Oligo6、Primer Premier等。

4、通常来说适合PCR的引物也会适合于qPCR实验，但是真正引物设计的时候我们不可能用全基因组作为背景去筛选合适的引物，大部分只是在我们的目标基因的序列上面去筛选引物，难免会出现在基因组其他地方有非特异性扩增这种情况。因此没有办法能够100%保证设计的引物合适，毕竟即使用基因组作为模板也很难保证基因组上没有变异位点。

5、如果第一次设计的引物不合适，可以重新设计，直到设计出合适的引物为止。本着节约科研经费的原则“不允许对1个基因1次设计多条qPCR引物进行筛选，一次只能设计一条，一条条的筛选是否可用。”。

1、打开在线引物设计网站：在线工具地址

在“Load server setting”的下拉框中选择“qPCR”。

在网页首页的文本框中将要设计引物的基因的cDNA序列粘贴到里面。

2、选择参数，设计引物

在”General Setting“菜单中选择参数。

首先要在Product Size Ranges中设定要设计的引物扩增片段的长度，我这里设定为“150-250”。

把Primer Size 和 Primer Tm值参数修改一下，如果后面设计不出来合适的引物可以再重新调整这里的参数。

所有参数都设置完毕之后点击“Pick Primers”开始设计引物。

3、导出引物并合成

弹出新的“results”菜单中就有最优的引物序列，粘贴出来，记录好Tm值即可。

把序列送到公司进行引物合成，选择最优惠的纯化方式就行，不影响后续的实验结果。

1、试剂

快速延伸Taq酶Mix预混液，超纯水、agarose电泳试剂

2、仪器

PCR仪、凝胶电泳仪、凝胶成像仪

1、选择一个模板，取出1 μL，加入99μL超纯水，将模板稀释100 倍。取出10 μL稀释后的样本加入新的离心管，加入90 μL超纯水，将模板稀释1000倍。

2、按照正常的PCR的反应体系来配置反应体系。

参考基因和靶基因的引物都需要进行验证。

3、按照下面的反应体系，使用快速扩增的Taq酶进行常规PCR扩增，并进行agarose凝胶电泳，观察是否能够扩增出来目的条带，扩增出来的条带是否单一，是否存在引物二聚体。

如果扩增出来的条带单一，没有引物二聚体，则说明该引物可以使用。

如果引物无法扩增出单一的条带或者扩增40倍之后仍然没有条带，则需要重新设计引物，并且重新进行PCR扩增验证。

这个时候应该使用该基因最有可能表达的样本来作为模板进行扩增，直到设计出合适的引物。

如果设计3次的引物仍然无法扩增出目的条带，而Ref基因可以正常扩增出条带，在确定自己引物设计没有问题的情况下可以认为基因没有表达。

验证引物的扩增效率需要用qPCR的试剂来进行扩增，通过Ct值来确定扩增效率，通常扩增效率在90~110%之间比较合适。

具体的方法参考下面的qPCR的步骤。

1、试剂

qPCR Mix预混液，超纯水

2、仪器

荧光定量PCR仪

1、Ref基因选择和平行设置

（1）最好做5个生物学平行（不同的样本是独立实验的个体），对于所有的实验，3个生物学平行都是最少的数量，但是一般来说真菌的实验需要设置至少5个生物学平行。

（2）如果只有3个生物学平行，最好每个样本做2个技术平行。

（3）最好选择2个或3个Ref基因，因为不同的参考基因在不同样本中的表达量可能也会存在差异，因此多个参考基因更有可能找到准确的参考基因。

2、qPCR试剂的选择

（1）一定要购买Mix试剂。

（2）所有正规的qPCR的试剂都可以使用，目前也没有哪个文献说某个品牌的qPCR试剂存在严重的误差。目前实验室采用的是SYBR Green I染料的试剂，因为这个试剂通用性最强，现在所有的荧光定量PCR仪的第一个通道基本上都是适用于SYBR Green I的通道（激发465-470nm，检测510nm）。

3、如何确定Ct值和模板使用浓度

（1）根据网上的资料Ct值在15-30是比较好的，可以通过半定量的结果吧所有基因的Ct值都调整到这个范围内。

内参基因的Ct值最好再15-18之间，因此用于内参基因扩增的模板浓度可以高一些。

（2）如何确定模板稀释倍数需要根据预实验中的半定量（不同循环数）的结果来确定。只要在agaraose电泳上面能够看到轻微的条带，就说明这个循环数已经超过了Ct值了，因此可以通过这种方法来初步判断一下Ref基因和靶基因的Ct值。

4、qPCR体系配置

（1）如何来配置qPCR体系

qPCR是定量实验，所以定量实验对于操作的要求都要远远高于定性实验。因此每一个操作步骤都可能会，每一种不同的体系的选择都会影响最终的定量结果的准确性。如果看一下各个公司的qPCR的Mix的说明书，大部分没有写需要如何添加Primer和模板。只是说明了需要添加的Primer的体积（0.4-0.8 μL/20μL体系），实际上因为Primer都是过量的，尤其是在Ct值循环数的时候，因此Primer的量对于结果影响不大。

(2)体系配置的几个基本原则

qPCR反应体系中影响最大的就是“反应总体系“ ”模板添加量“ ”体系如何配置“。

通常qPCR的反应体系在15-25 μL，体系越大相对越精准。考虑到qPCR试剂成本很高，我们实验室使用15 μL体系。

加入单个试剂的体积越大，准确度越高，因为如果加入体积太少，会因为溶液的虹吸效应导致吸不准。这个时候可以将Primer和模板稀释后加入，比如说15 μL体系里面需要加入0.4 μL的10 μM的Primer，但是0.4μL无法准确吸取，这个时候可以将Primer稀释5倍稀释为2 μM，加入2 μL的Primer就准确了。模板也是同样的方法处理。

qPCR实验的吸头不需要有滤芯或者无菌无酶，但是最好使用品质较高的吸头，实验室采用生工的吸头来进行qPCR实验。

（3）单个样本的体系配置

如果只有1个样本，Primer和Template跟其他的都不一样，可以按照下面的体系来配置。

（4）多个关联样本的体系配置

如果有多个关联样本，比如说模板一样，或者Primer一样，应该先把所有的一样的部分都加到一起，混合起来进行分装，再单独添加不同的试剂。

比如说所有的10个基因都是采用的同样的模板（和稀释倍数），那么就可以把qPCR MIx、模板先混合到一起，配置一个可以11份反应体系的Mix，再将Mix按照上面的体积，分装到10个qPCR管中（多余的试剂丢弃）。

qPCR过程中如何准确稀释、准确添加各个试剂是非常关键的，这方面可以参考“样本如何准确的稀释定量”。

5、扩增程序

不同的公司的qPCR Mix的扩增程序不同，我在博士期间使用的Mix是采用三步法，也就是跟普通Mix一样，50-60摄氏度退火，72℃延伸。现在实验室使用的Vazyme公司的“ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix”是采用两步法来进行扩增的，可以按照下面的程序设置qPCR程序。

PCR仪器的使用方法和结果导出方法请参考其他教程：

伯乐 CFX96TOUCH使用方法

Thermo Fisher ABI QS5使用方法

本方案适用于基因在不同的样本中的相对定量，采用2–ΔΔCT法，根据Ref基因来对表达量进行标准化。

相对定量，不像绝对量化严格，应用于大多数基因表达水研究。相对定量关注的并非某个基因的绝对表达量，而是同一基因在样本间的表达差异(如实验组和对照组)。结果以处理组相对于未处理组的表达差异倍数表示。这种分析方法不需要测定精确的拷贝数，重点是在与未处理样品组相比的表达变化上。

相对定量算法—ΔΔCt ΔΔCt方法是比较组别间同一基因表达差异的常用方法。通过将目的基因Ct(Ct 目的)与自身内参Ct值（Ct 内参）进行比较，可得到每一组别的ΔCt，再将实验组与对照组进行计算得到ΔΔCt。ΔΔCt的大小关联目的基因表达水平的倍数差异大小。

倍数差异 = 2–ΔΔCt

ΔCt 实验组 – ΔCt 对照组 = ΔΔCt

Ct 目的 实– Ct 内参 实 = ΔCt 实验组

Ct 目的 对– Ct 内参 对照 = ΔCt 对照组