PCR实验报告

7月19日     高遄

实验目的：了解PCR技术原理，掌握最基础的PCR实验步骤。

实验试剂：模板DNA，Mg2+，buffer，dNTPs，Taq DNA聚合酶，引物，H2O，石蜡油。

实验原理：

l PCR全称聚合酶链反应，是体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法。

l 基本原理：首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成2条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新的DNA互补链。PCR反应时，只要在试管内加入模板DNA、PCR引物、四种核苷酸及适当浓度的Mg2+，DNA聚合酶就能在数小时内将目标序列扩增100万倍以上。

（1）  双链模板DNA分子首先在高温下解开成长的单链，短链引物分子立即与该模板DNA两端的特定序列相结合，产生双链区。

（2）  DNA聚合酶从引物处开始复制其互补链，迅速产生与目标序列完全相同的复制品。

（3）  在后续反应中，无论是起始模板DNA还是经复制的杂合DNA双链，都会在高温下解开成为单链，体系中的引物分子再次与其互补序列相结合，聚合酶也再度复制模板DNA。

（4）  由于在PCR反应中选用的一对引物，是按照与扩增区域两端序列彼此互补的原则设计的，因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始并朝反方向延伸的，每一条新合成的DNA链上都有新的引物结合位点。

（5）  整个PCR的反应全过程，即DNA解链（变性）、引物与模板DNA结合（退火）、DNA合成（链的延伸）三步可以被不断重复。经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应该是2^n，能进一步满足遗传分析的需要。

l 试剂作用：

（1）       引物：DNA复制的起始点，针对复制DNA片段的两端，有5’引物和3’引物

（2）       Taq DNA聚合酶：促进dNTPs与模板结合。

（3）       Buffer：Tris-HCl反应缓冲液，Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。

（4）       Mg2+：对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

（5）       dNTPs：底物，在引物引导下合成与模板互补的DNA新链。

（6）       石蜡油：防止PCR加热过程中DNA蒸发。

l 试剂配置体积：

20μl体系中各试剂配置如下表：

l 温度和时间：

（1）       热启动：94℃，5~10min

（2）       变性：94℃，45~60s。

（3）       退火：50~65℃，1min。退火温度计算：Tm-（5℃~10℃），Tm（解链温度）=4（G+C）+2（A+T）。

（4）       延伸：72℃，1~1.5min。

（5）       步骤（2）~（4）热循环25~30个周期

（6）       保温：延伸72℃，10min

l  产物检测：凝胶电泳。

实验步骤：

（1）设计20μl体系各试剂配比：

（2）按照预先设计的20μl体积配置6管试管量，实际加入量如下表

将以上试剂按体积加入EP管中，震荡混匀后离心

（3）完成后分6管加入pcr管中，每管15μl体积，标注1-6号码。

（4）在前1-~4号PCR管中加入模板DNA，在5号管中加入C3H模板作为阳性参照，6号中不加任何模板DNA，作为阴性参照。

（5）在加完模板的6管试剂中各加入20μl石蜡油

（6）将PCR管放入PCR仪，按之前设定的加热温度与时间设置

a．热启动：94℃，2min；80℃，1min；

此时在各管中加入dNTPs 4μl

b．变性：94℃，30s；

c．退火：65℃，1.5min；

d．延伸：72℃，2min

步骤b~d循环40次

e．保温：72℃，10min

（7）完成后用3%琼脂糖凝胶（60ml）电泳进行检测。

实验结果：

PCR目标产物约为295bp

琼脂糖凝胶电泳结果如下图所示

             1    2     3     4    5    6   Marker

1、2号泳道为♂性小鼠DNA模板的PCR产物

3、4号泳道为♀性小鼠DNA模板的PCR产物

5号泳道为C3H阳性参照

6号泳道为阴性参照

由Marker参照可知，PCR产物大小约为290~300bp

         普通生物学实验报告

实验名称：用PCR扩增的方法鉴别不同物种来源的肌肉

一、特异性目的片段DNA的扩增

（一）实验原理

    聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，其基本原理为DNA的半保留复制。PCR技术由①高温变性模板 ；②引物与模板退火；③引物沿模板延伸这3步反应组成一个循环，通过多次循环反应，目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将模板DNA置于高温下（通常为93℃-94℃），使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因的两条单链互补结合；热稳定DNA聚合酶（Taq酶)在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板按5’→  3’的方向延伸，合成互补链。

本实验采用物种特异性引物扩增的方法来鉴定3种不同物种来源的肌肉。以不同物种来源的动物DNA为模板，用物种特异性的引物进行PCR扩增，只有在模板和引物的物种相对应的情况下才会有特异性条带的出现。应用此方法，可以特异性地检测样品中痕量的特定DNA成分。

（二）实验步骤

1.不同反应体系的配制

按下表将各成分分别加入一做好标记的无菌PCR管中，配制50μl的PCR反应体系，注意酶要最后加，加完后将PCR管放置在冰上。

2.将上述混合液稍加离心，约10s左右。取下后立即置于PCR仪中，盖紧热盖，定好PCR仪的反应程序，执行扩增程序。

反应程序为：

            预变性    94℃    5min

            变  性    94℃    5s       

            退  火    50℃    5s                    循环30次

            延  伸    72℃    20s

            后延伸    72℃    5min

3.反应结束后，终止程序，将PCR管取出，放置于4℃，待电泳检测。

二、水平式琼脂糖凝胶电泳法鉴定PCR产物

（一）实验原理

     核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液（pH 8.0-8.3)中，其碱基不解离，而磷酸集团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要是从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子。使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。

（二）实验步骤

1.制胶

称取2.4g琼脂糖，放入250ml的锥形瓶中，加入120ml1×TAE缓冲液，微波炉高火加热约40s直至沸腾，摇动，使琼脂糖分散，在重复煮沸2次，直至溶液澄清透明。待琼脂糖温度降到60℃左右时，按1:20000的浓度加入Golden View,混匀后倒入已插上合适齿孔梳子的模具中，静置，约30-45min后凝胶完全凝固。轻轻的垂直拔出梳子，将凝胶取出，放入电泳槽中，添加1×TAE缓冲液至刚好没过凝胶（有样品孔的一端靠近负极）。

2.加样

取15μlPCR产物与3μl的6×上样缓冲液混匀，加入到凝胶样品孔中。每加完一个样品应更换一个吸头。加样前，要记下加样的顺序。在每排样品孔中留出一个位置加入5μl的marker。

3.电泳

加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压100V，样品由负极向正极移动。当溴酚蓝移动到距离凝胶下缘约1/3时，停止电泳。

4.拍照

电泳完毕后，取出凝胶，采用凝胶成像系统拍照保存。

三、实验小结

（一）实验结果

                          PCR 产物电泳结果

由上图可以看出，样品1和样品6出现了目的条带 （大小约200bp），所以DNA模板1为猪肉DNA，DNA模板3为牛肉DNA,DNA模板2为兔肉DNA。

（二）实验讨论

1.在加入Taq酶时，应始终保持酶在冰浴中，不可握在手中。

2.每加完一次酶，都应更换吸头。因为在加酶时，吸头会插入液面以下，为防止污染，应更换吸头。

3.拔出梳子时，应两端一起用力，垂直，缓慢地拔出，以免破坏胶孔。

4.将样品与上样缓冲液混合时，要反复吸进，挤出溶液。为防止出现较多气泡，在每次挤出溶液时，可在吸头中残留少量溶液。

5.在加样时，吸头要垂直于凝胶板且不要插入太深，以免破坏样品孔。

6.我们组的电泳图中，条带不是很明显，应该是加样时样品的量不够充足，以后应注意。

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