本发明属水产养殖疾病防控领域，具体涉及一种大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株及其制备方法与应用。

背景技术：

1、大口黑鲈，又称加州鲈，是我国重要的经济养殖鱼类，具有养殖周期短、营养价值高、肉质鲜美等特点，深受养殖户和消费者欢迎。近年来，我国大口黑鲈养殖业发展迅速，养殖产量逐年升高，2020年全国养殖总产量超过60万吨。

2、近年来，病毒性烂身病是养殖大口黑鲈中流行性最广、危害性最大的病害之一，其病原为虹彩病毒科、蛙病毒属的大口黑鲈虹彩病毒(largemouth bass ranavirus，lmbv)。该病毒的主要流行期在5月至10月的高温季节，可感染不同规格的大口黑鲈，流行期的发病率可达80％以上，最高死亡率在60％以上，每年对水产养殖业造成了巨大的经济损失。疫苗作为一种绿色、健康的病害防控手段，在水产病毒病的防治中有着重要的价值。开展大口黑鲈虹彩病毒的疫苗研究，对推进大口黑鲈养殖的健康发展意义重大。

3、研发发现，蛙病毒主要侵染宿主的单核细胞，且具有较长的潜伏期，活毒疫苗所激发的细胞免疫将发挥重要的免疫作用。目前，关于通过基因缺失构建减毒疫苗株的报道并不少见，如伪狂犬病毒的tk基因缺失株、肿大细胞病毒vsocs/vtk双基因敲除株、虎纹蛙病毒vif2αh基因缺失株等，均能有效地降低病毒的毒力，并能起到有效地免疫保护效果。但是，目前尚没有关于大口黑鲈虹彩病毒基因缺失株构建的研究，制约着大口黑鲈虹彩病毒减毒疫苗的筛选和研制。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供一种大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株。

2、本发明第二方面的目的，在于提供一种带有筛选标记的大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株。

3、本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株的构建方法。

4、本发明第四方面的目的，在于提供本发明第二方面的带有筛选标记的大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株的构建方法。

5、本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株或本发明第二方面的带有筛选标记的大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株的应用。

6、本发明第六方面的目的，在于提供一种疫苗。

7、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

8、本发明的第一个方面，提供一种大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株，所述大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株为所述大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株为vβhsd基因缺失或敲除的野生型大口黑鲈虹彩病毒株。

9、优选地，所述vβhsd基因的基因序列为与seq id no:1所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。

10、进一步优选地，所述vβhsd基因的基因序列为与seq id no:1所示序列具有至少98％、至少99％或100％同源性的核苷酸序列。

11、本发明的第二个方面，提供一种带有筛选标记的大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株，所述带有筛选标记的大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株为vβhsd基因缺失，且在基因缺失的部位通过同源重组插入筛选标记基因的野生型大口黑鲈虹彩病毒株。

12、优选地，所述筛选标记基因包括绿色荧光蛋白基因和嘌呤霉素基因。

13、优选地，所述绿色荧光蛋白基因和嘌呤霉素基因通过t2a序列连接。

14、优选地，所述绿色荧光蛋白基因的序列如seq id no:2所示。

15、优选地，所述嘌呤霉素基因的序列如seq id no:3所示。

16、优选地，所述t2a序列如seq id no:4所示。

17、优选地，所述筛选标记基因的基因序列如seq id no:5所示。

18、优选地，在所述筛选标记基因的上下游均插入一段loxp序列。

19、进一步优选地，所述loxp序列如seq id no:14所示。

20、优选地，所述vβhsd基因的基因序列为与seq id no:1所示序列具有至少95％同源性的核苷酸序列。

21、优选地，所述vβhsd基因的基因序列为与seq id no:1所示序列具有至少98％、至少99％或100％同源性的核苷酸序列。

22、本发明的第三个方面，提供本发明第一方面的大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株的构建方法。

23、优选地，所述构建方法包括以下步骤：通过同源重组的方法将野生型大口黑鲈虹彩病毒株的vβhsd基因进行缺失，获得大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株。

24、本发明的第四各方面，提供本发明第二方面的带有筛选标记的大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株的构建方法，包括以下步骤：通过同源重组的方法将野生型大口黑鲈虹彩病毒株的vβhsd基因进行缺失，获得大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株。

25、优选地，所述构建方法具体包括以下步骤：

26、(1)分别扩增野生型大口黑鲈虹彩病毒株vβhsd基因的上臂基因和下臂基因；

27、(2)将步骤(1)的上臂基因和下臂基因分别连接到表达筛选标记基因的表达盒上，得到同源重组片段；

28、(3)将步骤(2)的同源重组片段转染鳜脑细胞，与lmbv病毒液混合孵育，收集病变且存在绿色荧光的细胞，即得到大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株。

29、优选地，所述筛选标记基因位于vβhsd的上臂基因和vβhsd的下臂基因之间。

30、优选地，采用引物对vβhsd-lf/vβhsd-lr对所述大口黑鲈虹彩病毒株vβhsd基因的上臂基因进行扩增；所述vβhsd-lf：5’-cggaattcgttatatttatatatccatctctgcatt-3’(seqid no:6)；所述vβhsd-lr：5’-cggactagtggtttgttttagatttcagcagtt-3’(seq id no:7)。

31、优选地，采用引物对vβhsd-uf/vβhsd-ur对所述大口黑鲈虹彩病毒株vβhsd基因的下臂基因进行扩增；所述vβhsd-uf：5’-aatgtatgctatacgaagttatttttcctcaaacaaacgtgtagttac-3’(seq id no:8)；所述vβhsd-ur：5’-cgaggtcgacggtatcgataagcttttgtaggcccaaacgttaaaatc-3’(seq id no:9)。

32、优选地，所述表达筛选标记基因的表达盒为通过将筛选标记基因亚克隆入pbluescriptⅱsk(+)多克隆位点的hind iii和ecor i得到的重组载体。

33、优选地，步骤(2)先将所述上臂基因与所述表达筛选标记基因的表达盒连接，具体包括以下步骤：利用ecor i和spe i内切酶对下臂基因和表达筛选标记基因的表达盒分别进行双酶切；利用t4连接酶将酶切后下臂基因连入酶切后第一重组载体，得到连接产物；将连接产物转入dh5α感受态细胞，得到第二重组载体；利用hind iii内切酶对第二重组载体进行单酶切，将上臂基因连入酶切后的第二重组载体中，转入dh5α感受态细胞，得到大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除所用的转移载体；利用spe i内切酶转移载体进行单酶切，得到线性化的转移载体。

34、优选地，所述构建方法还包括纯化步骤。

35、优选地，所述纯化包括采用有限稀释法纯化获得大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株，具体包括：将步骤(3)中与lmbv病毒液混合孵育后的病毒液再次感染鳜脑细胞，感染4～6h后更换含2μg/ml嘌呤霉素的培养基，继续培养，挑选发绿色荧光的细胞。稀释后再次感染健康的鳜脑细胞，继续培养、观察；如此反复，利用有限稀释的方法纯化8～15代后，获得大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因缺失株。

36、本发明的第五个方面，提供本发明第一方面的大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株或本发明第二方面的带有筛选标记的大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株在(a)～(c)中的应用；

37、(a)提供解析大口黑鲈虹彩病毒蛋白功能的工具；

38、(b)制备治疗或预防大口黑鲈虹彩病毒疾病的试剂或药物；

39、(c)制备诊断大口黑鲈虹彩病毒疾病的试剂。

40、本发明的第六个方面，提供一种疫苗，包含本发明第一方面的口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株或本发明第二方面的带有筛选标记的大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株。

41、优选地，所述疫苗还包括药学上可接受的诊断剂、载剂、赋形剂和稀释剂中的至少一种。

42、本发明的有益效果是：

43、本发明提供的大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除病毒株，该病毒株缺失vβhsd基因，进而降低了亲本毒株的毒性，具有良好的安全性能，为未来成功制备大口黑鲈虹彩病毒疫苗提供了理论依据和实践参考。

44、本发明还提供了带有筛选标记的大口黑鲈虹彩病毒vβhsd基因敲除株，通过在vβhsd缺失的部位插入筛选标记基因，有利于后续病毒株的筛选与纯化，该病毒株毒力很弱，作用于鱼类时，不会导致被感染鱼的大量死亡，从而达到免疫效果。

45、本发明提供了大口黑鲈虹彩病毒基因敲除株的构建方法：利用基因工程技术构建含有目的基因重组臂的重组转移载体，利用转染技术使得转移载体和野生型毒株发生同源重组，敲除目的基因，首次构建获得了大口黑鲈虹彩病毒的基因敲除株，该方法操作简单，有助于解决大口黑鲈虹彩病毒基因缺失株的构建问题，进而助力减毒或弱毒疫苗的开发和研制，为探究病毒基因功能及基因工程减毒活疫苗的构建提供了技术支持。