▋ DNA 纯化基础知识

人们如今对 DNA 的分析，通常是通过多重 PCR、real-time PCR 和对稀有事件的研究来进行的，因此高质量纯化 DNA 非常重要。高质量的分析产物是获得高质量的下游检测结果的必要条件。我们必须了解 DNA 纯化系统的工作原理，然后针对后续应用选择最适合的化学过程。

DNA 纯化常见的挑战

● 裂解样品从而释放 DNA● 将 DNA 分子与脂质、蛋白质、糖类和 RNA 等其他分子分离● 保持 DNA 分子的完整性

DNA 来源不同面临的挑战也不同。例如巧克力等食品，其中含有抑制性的化合物，如果这些化合物被已纯化的 DNA 携带，则可能抑制下游的检测。从革兰氏阳性细菌中分离 DNA 需要高效的裂解细菌厚厚的肽聚糖细胞壁。一定要确保你使用的 DNA 纯化方法能够解决样本面临的难题。

温馨提示：血液和组织样本在使用前需冷冻保存，以尽量减少核酸酶对 DNA 的破坏。在取出一小部分进行 DNA 纯化之前需将解冻后的血液完全混合。

DNA 纯化基本步骤

DNA 纯化：裂解、结合和洗涤

裂解：破坏细胞或组织-酶处理-机械破坏-去垢剂处理

裂解：使蛋白质变性或失去活性-离子去垢剂、加热、还原剂、尿素和胍类-蛋白酶（如蛋白酶 K）

裂解：使内源性核酸酶-螯合剂（例如 EDTA）-蛋白酶（例如 蛋白酶 K）

结合与洗涤：分离 DNA-去除其他核酸（如 RNA）-去除蛋白质     •有机萃取       •盐析       •与固相载体结合          -二氧化硅基质          -阴离子交换柱          -磁性颗粒

结合与洗涤：从其他细胞物质中分离 DNA 的方法

■ 有机萃取

当苯酚或苯酚: 氯仿混合物与细胞裂解物混合时，会形成两相：水相和有机相。极性 DNA 分子进入极性相或「水相」，而变性的蛋白质和其他细胞碎片则进入有机相。

■ 盐析

盐可以让蛋白质脱水，从而降低其亲水性，然后变性，变性后的蛋白质丧失溶解性从而沉淀；通过离心法去除沉淀的蛋白质和细胞碎片。常用的盐包括包括氯化钠、乙酸钾或乙酸铵。

■ 与固相载体结合

绝大多数的 DNA 纯化方法主要依据的原理是：通过选择性地与固相载体结合, 从而从粗裂解物中纯化 DNA。这类固相载体包括二氧化硅载体和阴离子交换树脂。通常来说，使用固相载体纯化 DNA 比其他方法用时更短、操作更便捷，因为不需要任何有机溶剂，而且可以微型化和自动化从而实现高通量。

与 DNA 结合的固相载体类型

二氧化硅基质：DNA 会在高浓度离液盐（例如盐酸胍）存在的情况下与二氧化硅结合，但是蛋白质不会。可以使用含有乙醇的洗涤液除去盐，然后在低离子强度的溶液（例如 TE 或水）中洗脱 DNA。

阴离子交换柱：纯化的主要原理是 DNA 中带负电荷的磷酸基团与交换柱上带正电荷的分子之间相互作用。在低盐条件下，DNA 与载体结合，而蛋白质和 RNA（取决于所用的缓冲液）则被洗涤除去。DNA 可以用高盐缓冲液洗脱。

在颗粒表面进行的 DNA 磁性分离：许多商品化试剂盒的工作原理是使用磁性颗粒从溶液中捕获 DNA。磁性颗粒可以由二氧化硅等材料制成，DNA 的结合和洗脱取决于盐浓度或 pH。

DNA 纯度、浓度和完整性

纯的、完整的 DNA 对于许多下游测定至关重要。常用评估 DNA 纯度的常用方法是在 260nm 的波长处（DNA 在该波长下有最大吸收峰）测定样本吸光度。通过测定 280nm 波长处的吸光度，并且计算 260nm 与 280nm 处的吸光度之比，可以检测出纯化过程中可能使用到的或残留在样本中的其他有机化合物。荧光染料和 qPCR 是计算 DNA 浓度并确定制品完整性的替代方法，主要在本指南后续关于核酸定量章节进行详细讨论。

图片来源：普洛麦格

编辑： 翟超男

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