病原微生物是威胁人类健康和食品安全的重要生物性因素，对公共健康造成负面影响。大部分致病菌在人体内环境和食品基质中并非以单个细菌及浮游状态存在，而是多以群体生物被膜(biofilm)形式生存。细菌的生物被膜是指细菌粘附于接触表面并嵌入自身产生的细胞外基质中的微生物群落[1]。胞外多聚物(extracellular polymeric substance，EPS)由胞外多糖、蛋白质、核酸、脂质和其他生物分子组成。EPS能固定生物被膜中的微生物群落，维持一系列高度复杂的动态变化，在生物被膜结构和功能方面均发挥重要作用，包括表面粘附、空间和化学异质性、生物被膜毒力构成，减弱抗菌剂的影响，及促进细胞间互作，从而增强生物被膜中细胞的代谢能力和耐药性[2]。细菌分泌的EPS促进菌体在生物和非生物表面附着，随后将细胞包裹聚集形成结构性群体。生物被膜中紧密排列的细胞在基质包裹的有限空间内互作，且EPS提供结构的机械稳定性及复杂的化学微环境[3]。此外，EPS还增强生物被膜菌对抗菌剂的耐受性[4]。目前，大多数研究集中在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、变形链球菌(Streptococcus mutans)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)等模式细菌的生物被膜，特别是单物种生物被膜产生的EPS基质组成和功能[1, 5]。鉴于此，本文阐述生物被膜EPS基质的组成成分和多种特性，分析模式细菌生物被膜和EPS相关的毒力内在关联，探讨靶向作用EPS基质的控制策略。

因微生物种属、局部剪应力、营养物质和底物利用及宿主环境不同，生物被膜EPS基质组成和结构有较大的差异[1]，且单种和多种细菌群落间EPS的分泌和空间组织结构也不同[2]。EPS组分影响生物被膜的结构和功能属性[4]，这些生物分子可分为两种类型：细胞表面的基质蛋白和分泌到胞外组分。细胞表面的基质蛋白，主要为细胞表面附属物，如鞭毛、Ⅳ型菌毛和功能性淀粉样蛋白等。细胞表面附属物通过影响细菌运动和固体表面附着，调节细菌黏附、机械稳定性和群体感应等功能。胞外组分包括分泌于菌体外的胞外多糖、蛋白质、胞外DNA (eDNA)和胞外RNA (eRNA)，与基质支架和功能有关[1-2]。目前铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌等多种模式菌的EPS生物大分子已被鉴定和报道(表 1)。

生物被膜EPS基质由多种功能性生物分子组成，包括胞外多糖、蛋白质、eDNA和脂质。其中，铜绿假单胞菌胞外多糖Pel、Psl、藻酸盐，金黄色葡萄球菌多糖细胞间粘附素(PIA)，变形链球菌的葡聚糖/果聚糖，霍乱弧菌多糖，枯草芽孢杆菌epsA-epsO操纵子编码的胞外多糖，对生物被膜三维空间结构的形成起主导作用。铜绿假单胞菌蛋白IV型菌毛素、凝集素(LecA、LecB)、结构基质蛋白CdrA，枯草芽孢杆菌蛋白生物被膜表层蛋白(BslA)、易位依赖抗菌孢子组分(TasA)、鞭毛，金黄色葡萄球菌蛋白纤维连接蛋白结合蛋白(FnBPs)、葡萄球菌蛋白A (SpA)、表面蛋白G (SasG)、生物被膜相关蛋白(BAP)，变形链球菌蛋白葡萄糖基转移酶(Gtf)、果糖基转移酶(Ftf)、葡聚糖酶、P1粘附素(AgI/II)、葡聚糖结合蛋白Gbps、霍乱弧菌被膜相关蛋白(BAP1)、基质蛋白RbmA/RbmC、MshA菌毛，是构成生物被膜骨架的重要成分。胞外多糖和胞外蛋白基质可作为生物被膜在动态环境的支架，维持空间结构的稳定性，并为微生物群落提供各种化学和物理信号，从而促进生物被膜的形成、发育和成熟[3]。混合生物被膜中某些微生物在种属的互作中会分泌更粘稠和更多的胞外基质，导致共聚集，促进形成致密、稳定的空间结构，如希瓦氏菌等4种共培养海洋微生物[6]、金黄色葡萄球菌和荧光假单胞菌混合被膜[7]。

细菌除自身产生EPS外，还能从宿主或周围环境获得的生物分子作为EPS基质。研究发现，宿主蛋白和糖蛋白(如唾液蛋白)可作为微生物营养的来源，也有利于基质支架的形成，促进菌体的附着[2]。另外，在生物矿化过程中形成的矿物质也能为生物被膜基质提供完整性结构，作为支架保护细菌免受抗菌剂的伤害[8]。已发现革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌和分枝杆菌的生物被膜诱导碳酸钙矿物的产生，抵抗不利环境条件，并提高微生物群落的整体适应性[9]。本课题组也发现氯化钙介导食品致腐细菌-荧光假单胞菌生物被膜的形成，使其被膜结构更致密[10]。

细菌生物被膜的形成是一个动态过程，EPS基质在被膜发育、发展和成熟阶段有多种功能，与菌体的粘附、支架、机械稳定性和保护作用密切相关。生物被膜形成的初期阶段，细菌在宿主表面的初期粘附以粘附素-受体作用为主，还有表面扫描和传感。霍乱弧菌可利用鞭毛等结构作为机械传感器[1, 11]，寻找合适的粘附位点。霍乱弧菌基质蛋白BAP1参与生物被膜菌与介质表面的粘附，RbmA介导表面附着特性[11]。铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、霍乱弧菌等细菌从初期的细胞聚集转变为微菌落过程中，都有EPS介导的粘附作用[4-5, 12-13]。另外，EPS还参与混合生物被膜的共粘附，枯草芽孢杆菌分泌的EPS蛋白TasA可介导链球菌种间聚集[14]。在混合群落细菌的初期粘附中EPS分泌菌比非EPS菌更具竞争优势[15]。

在生物被膜发育阶段EPS能促进细胞间识别/共粘附和微生物聚集[1]，其中菌种间以机械传感或特定粘附素(蛋白)-受体(多糖)为主要的作用方式。在共培养环境下具有生物被膜形成能力的细菌可以架桥非被膜生成菌，出现共聚集作用，从而提高共生混合菌种的被膜形成能力[16]。以EPS基质介导的生物被膜组装包括：(1) 被膜菌在粘附位点分泌的EPS构成最初胞外基质，促进细菌定殖和细胞聚类；(2) 持续分泌的EPS形成内部包裹菌体核心结构的三维空间基质；(3) 该核心结构提供三维聚集体或微菌落的形成[3]。随着生物被膜的发育，EPS原位产生形成复杂的3D基质支架，内部包裹聚簇状分布的微生物细胞，为高度分隔的生物被膜菌提供凝聚力和机械稳定性[5]。Erskine等[14]报道枯草芽孢杆菌中淀粉样不溶性EPS结合被膜内部的菌体，稳定空间网络和支架作用。变形链球菌的P1粘附素(AgI/II)[15]、芽孢杆菌形成的非酰化TasA[17]、假单胞菌Fap纤维[18]、金黄色葡萄球菌Bap纤维[19]也能形成功能性淀粉样蛋白(淀粉样纤维)，增强生物被膜的结构稳定性，保护菌体。

随着生物被膜进入成熟阶段，被膜基质中胞外多糖和eDNA良好的粘弹性使被膜菌在持续的流体剪切应力或高机械压力下难以脱离，提高被膜菌对环境应激因素的适应性和保护性反应[20]。除机械阻力外，EPS还可作为扩散限制屏障因子，阻止各种抗菌剂和药物进入生物被膜的深层[21]，从而增强生物被膜对抗菌药物的耐受性[1, 5, 15]。并且生物被膜基质中存在某些酶也能分解抗生素，使其失活[22]。EPS基质也为生物被膜菌抵抗机械清除、抗菌剂和宿主免疫力提供物理稳定性，然而相关的机制有待深入研究。

EPS基质不仅作为物理屏障阻止多种物质，还影响多种分子在生物被膜中扩散，从而使多种营养和化学成分在被膜空间结构中形成梯度分布，如氧、pH、信号分子、无机离子、代谢物等。因此，异质性的生物被膜微环境受到不同浓度化学成分的影响，还与EPS和微生物代谢互作有关。研究发现，不同氧气丰度的铜绿假单胞菌和大肠杆菌生物被膜中EPS相关基因表达和代谢有差异[23]。并且，生物被膜空间结构中微环境的pH分布也不同[24]，变形链球菌的生物被膜结构中某些微菌落中EPS基质能形成酸性梯度的微环境，从而调节多种pH应答的atpB基因差异表达[25]。

另外，生物被膜基质的另一化学功能是作为多种生物分子的营养储藏场所，如发酵多糖[5, 26]。最近研究表明，由于霍乱弧菌生物被膜中渗透压差异，微生物菌落出现生理性的膨胀，从而最大程度地接触营养成分、吸收养分。同时，生物被膜基质还可以作为外部消化系统，与外源酶参与EPS的合成和分解及不同底物的新陈代谢活动密切相关[2]。变形链球菌的葡聚糖酶和果聚糖酶分别降解生物被膜EPS组分中的可溶性葡聚糖和果聚糖，生成可发酵的多糖，在饥饿胁迫时被利用[2]。eDNA作为一种碳源，能影响被膜解离，而带阴离子的EPS成分和eDNA可作为阳离子螯合剂，从而提高菌体抗菌性。当然，其他基质成分在被膜营养沉积和化学梯度形成中的作用仍需阐明。

生物被膜是一种异质性、EPS包裹的环境，能够改变该局部基因表达、代谢活性及被膜内多物种细胞间的信号传导[3-4]。最近研究表明，多种胞外和胞内信号分子参与调节被膜基质基因表达和代谢通路[27]。群体感应(quorum sensing，QS)是一种细胞密度依赖的细胞-细胞间信号机制，与生物被膜基质调控密切相关。铜绿假单胞菌至少存在las、rhl、pqs和iqs四种群体感应系统，信号分子与相应的受体结合，能激活与生物被膜发育、毒力因子和次生代谢相关的多种基因转录[27]。胞外多糖促进生物被膜内QS分子的吸收，而生物被膜基质可以激活或淬灭QS活性[28]。而环二鸟苷酸(c-di-GMP)是一种普遍存在于细菌胞内的核苷酸类小分子，参与调控假单胞菌生物被膜形成等多种生理功能。铜绿假单胞菌中有c-di-GMP代谢相关的多个GGDEG和EAL结构域蛋白，参与生物被膜主要组分-胞外多糖前提物质糖原的表达，还与被膜形成的菌毛、粘附素表达和胞外多糖合成的调控有关[27]。

EPS基质的物理和化学特性对生物被膜形成和毒力表达发挥重要作用。被膜基质中群体微生物行为和功能，被认为构成了生物被膜毒力。某些基质成分可以通过影响黏附-共聚集、致病微环境、机械和药物抗性[3]等因素，作为潜在的毒力因子[1-2, 4]，引起人和动物发生疾病。葡萄球菌EPS中的eDNA和聚N-乙酰氨基葡萄糖表面多糖(PNAG)可参与宿主定殖和抗菌素耐药等多种毒力[29]。

细菌生长和致病过程中往往分泌蛋白酶和其他胞外酶，如脂肪酶、酯酶、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶和纤溶酶等。研究显示，细菌被膜EPS的葡聚糖促进菌体粘附-聚集、物种间互作和生物被膜积累，也有助于形成保护性和高度酸性的微环境[2, 30]。已报道变异链球菌中葡萄糖基转移酶(Smu_833)可调控葡聚糖和eDNA两种生物被膜基质成分，而Smu_833基因的缺失株葡聚糖含量下降，eDNA成分增加，在大鼠龋齿模型中体内毒力下降[30]。

宿主体内的病原体EPS组分对细胞间互作也起重要作用[13]，尤其肠道细菌被膜基质。肠道生物被膜的EPS有淀粉样Curli蛋白、eDNA、O抗原、纤维素和BapA表面蛋白等[31]，与自身免疫性疾病、帕金森病有关。肠道被膜EPS组分为病原体相关分子模式(PAMPs)，能激活促炎性先天免疫受体，如Toll样受体(TLR2、TLR9)、LPS受体CD14和炎性小体NLRP3。大肠杆菌和沙门氏菌等肠杆菌产生的Curli是一种典型的功能淀粉样纤维，也是生物被膜形成中细胞外基质重要的组分，且能与基质直接结合，在菌体细胞间形成稳定的三维结构束。大肠杆菌Curli不仅保护菌体，而且通过阻断补体1q (complement component 1q，C1q)增强其毒力[14, 32]。其他功能性淀粉样蛋白或纤维在细菌生物被膜菌的毒力中也起作用，如铜绿假单胞菌的Bap纤维、芽孢杆菌的TasA纤维和金黄色葡萄球菌的Bap纤维[17-19]。

多功能EPS基质在生物被膜形成初期的菌体定殖、被膜发育和成熟、及其毒力基因表达的整个生物被膜发育周期都必不可少。由于基质复杂的物理、化学和生物学特性，常规的抗菌方法并不适用于生物被膜菌感染的控制，而需要多靶点或联合治疗。Karygianni等[3]提出以基质为靶点，清除不同物种普遍存在的EPS成分，可能成为细菌感染中抗混合生物被膜作用的潜在思路。目前，生物被膜基质的控制可以通过抑制EPS形成和降解成熟生物被膜EPS两条途径实现(图 1)。

生物被膜EPS的产生受多种胞外/胞内信号网络和非信号机制的调节，阻断这些通路能有效控制生物被膜的形成[4, 33]。QS、c-di-GMP和环腺苷二磷酸(c-di-AMP)调控多种EPS产生的外酶、多糖和粘附素，抑制QS和核苷酸通路可影响多种EPS形成的代谢过程[34-35]。细胞内高水平的c-di-GMP会诱导胞外多糖基质分子Psl和Pel高表达，促进细菌粘附聚集和生物被膜形成[35]。多种植物精油能影响假单胞菌等细菌的信号交流，从而影响生物被膜的粘附和稳定[7]。脱氧核糖核酸酶(DNase)能切割单链和双链DNA、降解DNA，有效地破坏生物被膜的稳定性[34]。另外，粘附素生成抑制剂或粘附素结合分子可通过阻断EPS介导的粘附，靶向影响EPS与宿主的互作，阻止细菌生物被膜的形成(图 1左)。然而，许多细菌与宿主表面结合时表现多受体-配体相互作用，因此抑制细菌定殖需要同时阻断多个粘附位点[13]。

微生物一旦分泌大量生物被膜基质，形成保护性的微环境，抑制EPS合成或阻止粘附相互作用的策略就不可行[36]。成熟生物被膜中形成的EPS可使用酶或其他抑菌剂降解，破坏基质的物理完整性，促进生物被膜的破坏和清除[19] (图 1中)。Baker等[37-38]使用糖苷水解酶PslG靶向分解EPS中的胞外多糖，在体外破坏铜绿假单胞菌的成熟生物被膜。EPS降解酶可作为常规抗菌剂的辅助剂，增强药物渗透性和微生物杀灭活性[34]。研究表明，葡聚糖基水解酶、糖苷水解酶和脱氧核糖核酸酶联合使用可以增强抗生素或抗菌肽对体外成熟生物被膜的杀伤力，提高抗菌药物的转运能力[39]。此外，机械、能量和光破坏等物理清除也是干预EPS的方法[36]，如光动力和光热治疗、超声波和激光冲击波技术、及高速喷射和洗刷(图 1右)。光动力疗法中使用特定波长的光源来照射无毒的光敏剂，如四吡咯、合成染料或天然化合物，以产生活性单态氧，破坏生物被膜杀灭微生物[40]。

新技术和生物/纳米材料为控制EPS介导的生物被膜和毒力提供了新方向。第一类是缓释的有机药物纳米载体，其具有生物相容性，能渗透到生物被膜内部，进入致病菌微环境后受触发以递送药物或多功能化合物(从催化纳米颗粒到适配体，树状聚合物和生物活性肽)，以破坏EPS和内部菌体的活性或代谢[3]。抗菌肽和适配体还具有特定的生物被膜靶向特性，可用于提高纳米颗粒(杂化纳米颗粒)的特异性和有效性[22]。第二类作为生物被膜靶向剂或纳米涂层的无机金属纳米粒子，如银、铜、氧化铁和金。最近研究表明，氧化铁(Fe3O4)有类似过氧化物酶活性，以剂量和pH依赖方式催化过氧化氢(H2O2)产生羟基自由基，降解生物被膜基质，从而快速杀灭内部的被膜菌[41]。此外，利用益生菌或噬菌体治疗EPS也被认为是潜在的抗生物被膜技术。Lu等[42]设计T7噬菌体表达EPS降解酶，在感染大肠杆菌中比不表达酶的噬菌体抗生物被膜活性显著增强。

由于生物被膜生物学特性的复杂性，如果微生物被膜菌和EPS基质的控制策略可以同时干扰被膜形成及破坏已产生的生物被膜，则是一种更为有效和精准的方法。上述这些方法单独或联合使用，都可以抑制生物被膜的形成，破坏生物被膜的完整性。

细菌分泌的多种EPS基质对维持生物被膜结构的稳定性和支架发挥重要作用，还参与生物被膜组装、群体行为和毒性的功能特性，如信号传导、遗传交换、微环境形成、机械稳定性和抗生素耐受性等。微生物种类和代谢活性、营养物质的可利用性、宿主环境和生长阶段都影响EPS成分和结构的可变性，为开发以EPS为靶点的药物和技术增加难度。尽管部分研究已揭示了某些模式微生物的生物被膜体系中EPS基质组成和功能，然而复杂的信号分子与生物被膜形成和毒力因子表达的潜在机制仍需阐明，多菌种的混合生物被膜中不同微生物如何共同调节发育和成熟的生物被膜中EPS组分的机制有待于进一步研究。