琼脂糖凝胶电泳

什么是琼脂糖凝胶电泳？

       琼脂糖凝胶电泳是一项通过核酸（如DNA）分子大小进行物质分离和识别的技术。举例说，将不同大小的DNA片段加载到由红藻提取的碳水化合物琼脂糖制成的多孔凝胶上。在电场的作用下，由于DNA带有负电荷的磷酸集团，片段将在凝胶中移动。较小的DNA片段移动较快，而较大的片段移动相对较慢。电泳结束后，比较DNA样品位置与一系列已知大小的DNA片段（称为DNA分子量标准样）的位置，可以获得准确的分子大小信息。       然而，对于RNA而言，由于其常形成二级结构，有时同一片段可能存在多个不同的种类，这使得其迁移方式复杂。因此，观察到的条带不总是准确反映它们的实际尺寸，导致图像模糊。       在这种情况下，琼脂糖天然凝胶通常不适用于RNA大小分析，尽管它们可以提供数量和完整性的估计。替代方法包括RNA印迹法和变性琼脂糖凝胶电泳，它们使用的条件可以破坏二级结构。       琼脂糖凝胶也可用于根据蛋白质的大小和电荷进行分离。与DNA/RNA不同，蛋白质的电荷取决于其含有的氨基酸类型。然而，由于琼脂糖凝胶的孔径较大，通常使用聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质分离，因其孔径较小，可提供更高分辨率，特别适用于小蛋白质分子。 

工作原理：

        琼脂糖，作为琼脂的成分之一，构成了一个立体的凝胶基质，由螺旋状的琼脂糖分子组成。这些螺旋状的分子通过氢键在超线圈束中紧密固定，形成通道和孔隙，使分子能够穿过。在加热的过程中，这些氢键断裂，导致琼脂糖从凝胶状态变为液体状态，使其可以在恢复形状前被倒入模具。

【图片1】琼脂糖凝胶中的孔隙形成和温度诱导的状态转变。

       凝胶中琼脂糖的含量直接调控了孔隙的尺寸，进而影响了分子的可透过性和迁移速度。百分比较高的琼脂糖使孔径减小，因而只有较小的分子可以通过，其迁移速度也较慢。       在分子生物学实验室中，常使用0.7~1%的琼脂糖凝胶进行日常DNA分离。这种凝胶对0.2-10kb范围内的片段提供了明显而清晰的分辨率。较大的DNA片段可以采用较低百分比的凝胶，但会变得易碎难处理，而较高百分比的凝胶则能更好地分辨小片段，但可能凝固不均匀。       鉴于DNA在肉眼中无法直接观察，因此在凝胶凝固时会加入一种夹层染料，如溴化乙锭（EtBr），以渲染凝胶。该染料会与DNA结合，并在紫外线照射下发出荧光，使得DNA片段成为可见。DNA的存在越多，相应的条带就会越亮。       与加载染料混合的样本被放置在凝胶的一端，凝胶被浸泡在运行缓冲液中。然后电流通过凝胶槽两端的电极穿过凝胶。

【图片2】琼脂糖凝胶放置在缓冲液槽中，样品与加载染料混合后放置在凝胶一端的孔中，施加电流使带负电的DNA向正电极（阴极）移动

       在样品充分分离后，将凝胶从槽中取出，置于紫外光箱上。夹层染料使得样品的条带可见，通过与已知大小的DNA标记进行比较，可以确定其尺寸。由于迁移距离和片段大小之间存在非线性关系，因此包含尺寸标记是至关重要的，可用作指导分析的依据。

A）图片左侧描述了DNA电泳的典型结果。在左边，有一个尺寸标记，用来作为样品DNA片段长度（以碱基对为单位）的参考。标记的右边是三个样品。图片显示了较小的DNA片段如何在琼脂糖凝胶中比较大的DNA片段移动得更远。B) 图片右侧的图表显示了DNA片段的大小与迁移距离之间的非线性关系。这是一条负的曲线，当DNA片段变大时，它们在凝胶中迁移的距离就会减少。 

实验材料：

        DNA、琼脂糖、TBE电泳缓冲液、电泳载样缓冲液、溴化乙锭(EB)溶液母液、 DNAGreen、水平式电泳装置、电泳仪、台式高速离心机、恒温水浴锅、微量移液枪、微波炉或电炉、紫外透射仪、照相支架、照相机及其附件。 

实验步骤：

一、试剂配制        1、5×TBE缓冲液：450 mmol/L Tris-硼   酸，10 mmol/L EDTA，pH值8.0。使用时将上述储存液稀释10倍至0.5×TBE缓冲液，可同时作为电泳及制胶用的缓冲液。

二、制胶        1、根椐制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉（总液体量不宜超过锥瓶的50%容量）。        2、在锥瓶的瓶口上盖上保鲜膜或牛皮纸，并在膜或纸上扎些小孔，然后在微波炉中加热溶解琼脂糖。加热时，当溶液沸腾后，请戴上防热手套，小心摇动锥瓶，使琼脂糖充分均匀溶解。此操作重复数次，直至琼脂糖完全溶解。        3、使溶液冷却至50℃-60℃左右，如需要可在此时加入溴化乙锭溶液（终浓度0.5  μg/ml）或按照1 μL / 30 mL的比例加入DNAgreen染料，并充分混匀。        4、将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在3~5 mm之间。制胶模如下图所示，小胶倒入25-30 mL左右琼脂糖溶液，大胶则60-70 mL左右，若需切胶回收，凝胶可适当加厚。        5、在室温下使胶凝固，大约30分钟~1小时。

三、上样         1、取适量样品与6×上样缓冲液混匀（如：1 μl样品与5 μl 6×上样缓冲液），用微量移液枪小心加入样品槽中。         2、上样量根据样品浓度可适当调整，若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量（一般小孔40 μl 为上限，大孔200 μl 为上限，具体和制胶膜规格相关）。         3、每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

四、电泳         1、加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在110 V，电流在40 mA以上。         2、当条带移动到距凝胶前沿约2 cm时（约40 min），停止电泳。         3、紫外下拍照并观察。 

注意事项：

         1、5×TBE缓冲液放置时间过久会沉淀，因此一次性不要配太多。工作用电泳缓冲液为0.5×TBE缓冲液，取5×TBE缓冲液贮存液稀释，现配现用。         2、用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。         3、琼脂糖粉在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。溶解琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。         4、凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保存，一般可保存2～5天。 

其他：

琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围：

关注我们：

          广州誉嘉生物科技有限公司，专注于生命科学最前沿科研技术服务，具有较好的生物学和医学技术服务平台，能够提供实验课题设计、论文编辑润色，以及细胞实验、动物模型、病理检测、分子实验、免疫检测、病毒包装、组学服务、基因编辑等整体课题一站式服务。我秉承“少承诺，多做事，用行动获取客户口碑”的经营理念，努力为广大客户提供最优质、高效的服务，用实实在在的优质实验技术换取客户的信任，相信在未来的工作中，一定能够成为您的得力助手和值得信赖的合作伙伴。