本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种狂犬病毒裂解液及其应用。

背景技术：

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)感染引起的一种病症严重、病死率极高的自然疫源性人兽共患传染病，死亡率几乎100％，目前尚无有效的治疗措施。野生动物是RV的主要储存宿主，人一旦被携带狂犬病毒的此类动物咬伤，就会感染发病，其病死率为100％。根据卫生部最新公布的传染病疫情统计数据，显示近年来狂犬病继续呈现凶险的迹象。但是狂犬病没有特殊有效的治疗手段，注射狂犬病疫苗是唯一有效手段。目前市场上的狂犬病毒疫苗基本都是采用转瓶工艺传代细胞培养的，大规模生产需要大量的物力人力资源，成本较高，并且批间差异大，质量不稳定。高效的疫苗生产需要大量的以高产量从宿主系统中生产出病毒。病毒株生长的培养条件对于获得该株系的可接受的高产量来说具有重大意义。因此，为了最大化所想要的病毒的产量，系统和培养条件都必须特定地适合于提供对于产生所想要的病毒来说有利的环境。

狂犬病疫苗大部分是用于暴露后的免疫，就要求疫苗在更高的效力前提下还要保证安全。现有狂犬病疫苗无论采用何种病毒培养体系，最终均是经适宜方法制成含全病毒颗粒的疫苗。这类疫苗的缺点就在于无法进一步增加抗原含量从而在人体中产生更快、更高的免疫应答反应、提供更久的免疫保护。其原因为进一步增加病毒抗原含量时，病毒颗粒中与抗原无关的成分特别是那些变态反应原物质，如病毒杂蛋、病毒核酸及脂质以及培养病毒的组织或细胞的残余蛋白也随之增加，因此疫苗副反应就加大。

已证实，存在于狂犬病病毒外膜刺突地G糖蛋白是唯一能产生中和抗体的抗原，能使病毒吸附在宿主细胞上并进入细胞内，G糖蛋白决定病毒毒力和免疫原性及病毒的复制、是狂犬病毒主要的活性成分，基质蛋白对G糖蛋白的抗原性有增强效应。

目前现有的裂解液裂解狂犬病毒的方法存在很多缺点，裂解试剂体系单一，样本处理耗时长，狂犬病毒裂解效果不佳，裂解不完全，病毒外膜片段获得率低，纯度低；上述缺点的存在势必会因狂犬病毒裂解液的选择而导致对后续的狂犬病毒抗原的效果造成影响。

技术实现要素：

为克服现有狂犬病病毒裂解液存在的缺点和不足，本发明提供了一种狂犬病毒裂解液，该裂解液裂解效率高、使用安全。

本发明还提供了一种上述狂犬病毒裂解液在制备狂犬病毒抗原中的应用。

一种狂犬病毒裂解液，该裂解液包括裂解液A和裂解液B，其中所述的裂解液A含有以下组分：N-月桂酰肌氨酸钠 1-2g/100ml、Triton X-100 0.2-1.0g/100ml、糖元1mg-5mg/100ml，pH为6-6.5；

所述裂解液B含有以下组分：氯化钠 0.7-1.0g/100ml、EDTA 1-1.5g/100ml，pH为7-7.5。

上述狂犬病毒裂解液在制备狂犬病毒抗原中的应用。

利用上述狂犬病毒裂解液制备狂犬病毒抗原的方法为：

（1）制备狂犬病病毒液；

（2）对步骤（1）所述的狂犬病病毒液进行浓缩、纯化；

（3）在步骤（2）所述的纯化后的狂犬病病毒液中加入病毒裂解液A，涡旋震荡，待彻底混匀后，在9-12℃下水浴30-40min；

（4）在步骤（3）所述的裂解混合液中加入病毒裂解液B，涡旋震荡，待彻底混匀后，在15-20℃下水浴18-25min；

（5）步骤（4）处理后的裂解混合液进行纯化，用25%蔗糖、40%蔗糖和55%蔗糖作为蔗糖密度梯度，以20000-25000rpm/min的速度离心0.5-1小时，收集病毒外膜片段部分；

（6）在步骤（5）收集的病毒外膜片段部分中加入磷酸缓冲盐溶液至pH7.2，静置30-40min，经50-60KD滤膜超滤浓缩，透析脱糖后回收病毒外膜片段原液，即为狂犬病毒抗原。

优选地，所述步骤（3）中病毒裂解液A和狂犬病病毒液的体积比为1-2：3；所述步骤（3）中病毒裂解液B和狂犬病病毒液的体积比为1-2:3。

优选地，步骤（5）中纯化的具体过程为：当区带离心转速达到3000rpm/min时，泵入病毒液、25%蔗糖、40%蔗糖和55%蔗糖，并加入PBS作为封闭液，进样完毕，再调节机器转速至20000-25000rpm/min，离心0.5-1小时。

本发明所用的狂犬病病毒固定毒株为：CTN-1V，aGV株。中国药品生物制品检定所负责制备和发放上述病毒毒种。

有益效果

使用本发明中提供的狂犬病毒裂解液，可有效裂解狂犬病毒颗粒，有利于提取含有刺突和基质蛋白的病毒外膜片段。本发明提供的裂解液可在制备狂犬病毒抗原中应用，该应用方法简单快速，且裂解完全，裂解液容易去除，获得的狂犬病毒抗原纯度高。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1

1.狂犬病毒裂解液及其配制方法：

裂解液A的配制：称取N-月桂酰肌氨酸钠5g、Triton X-100 5.0g、糖元5mg，加入无菌水定容至500ml，充分混匀溶解，使用氢氧化钠或盐

酸溶液调节pH值至pH为6，高压灭菌10min；

裂解液B的配制：称取氯化钠3.5g、EDTA 7.5g，加入无菌水定容至500ml，充分混匀溶解，使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH为7，高压灭菌10min。

2.狂犬病毒裂解液的应用：

将Vero细胞于37℃培养，并经连续传4代。第4代细胞培养3-5天后，用磷酸缓冲液淋洗，接种病毒滴度为不低于7.5LgLD50/ml的狂犬病病毒固定毒CTN-1V株。并加入细胞维持液于35℃培养24小时。换入新鲜细胞维持液，按照上述条件继续培养2-4天，当细胞病变CPE达到++～+++时，收获、合并病毒液。按照1∶4000加入β-丙内酯，置于22℃、8天灭活病毒。经灭活试验验证合格后，用100KD滤膜超滤浓缩。于浓缩后的病毒液中加入10mg/ml的硫酸鱼精蛋白，使其终浓度为0.1mg/ml，8000rpm离心后，上清液除菌过滤，再经Sepharose4FF凝胶柱层析，收集得到纯化后的狂犬病病毒液。根据收集的纯化狂犬病病毒液体积，加入病毒裂解液A，涡旋震荡，待彻底混匀后，在9℃下水浴40min后，加入病毒裂解液B，涡旋震荡，待彻底混匀后，在15℃下水浴25min，使狂犬病毒颗粒充分彻底裂解；其中病毒裂解液A和狂犬病毒液的体积比为1:3；病毒裂解液B和狂犬病毒液的体积比为2：3。

裂解后的病毒液进行二次纯化，当区带离心转速达到3000rpm/min时，泵入病毒液、25%蔗糖、40%蔗糖和55%蔗糖，并加入PBS作为封闭液，进样完毕，再调节机器转速至20000rpm/min，离心1小时，收集病毒外膜片段部分。

在收集的病毒外膜片段部分中加入磷酸缓冲盐溶液至pH7.2，静置30min，经60KD滤膜超滤浓缩，透析脱糖后回收病毒外膜片段原液，即为狂犬病毒抗原。

3．动物免疫实验及病毒攻击保护实验：

将收集的狂犬病毒抗原与等体积油佐剂混合试制疫苗，在小白鼠上进行动物试验。0.5ml/只经肌肉或口服途径各免疫20只小白鼠，另设10只小白鼠不注射任何东西为对照组。一个月后，用致死性狂犬病毒cvs标准攻毒株经脑内攻击，结果试验组获得70%的保护，而对照组全部发病。

本实施例所制备的抗原无论注射还是口服的动物80-90%都产生保护性抗体。

实施例2

1.狂犬病毒裂解液及其配制方法：

裂解液A的配制：称取N-月桂酰肌氨酸钠10g、Triton X-100 1g、糖元25mg，加入无菌水定容至500ml，充分混匀溶解，使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至pH为6.5，高压灭菌10min；

裂解液B的配制：称取氯化钠5.0g、EDTA 5g，加入无菌水定容至500ml，充分混匀溶解，使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH为7.5，高压灭菌10min。

2.狂犬病毒裂解液的应用：

将Vero细胞于37℃培养，并经连续传4代。第4代细胞培养3-5天后，用磷酸缓冲液淋洗，接种病毒滴度为不低于7.5LgLD50/ml的狂犬病病毒固定毒CTN-1V株。并加入细胞维持液于35℃培养24小时。换入新鲜细胞维持液，按照上述条件继续培养2-4天，当细胞病变CPE达到++～+++时，收获、合并病毒液。按照1∶4000加入β-丙内酯，置于22℃、8天灭活病毒。经灭活试验验证合格后，用100KD滤膜超滤浓缩。于浓缩后的病毒液中加入10mg/ml的硫酸鱼精蛋白，使其终浓度为0.1mg/ml，8000rpm离心后，上清液除菌过滤，再经Sepharose4FF凝胶柱层析，收集得到纯化后的狂犬病病毒液。根据收集的纯化狂犬病病毒液体积，加入病毒裂解液A，涡旋震荡，待彻底混匀后，在12℃下水浴30min后，加入病毒裂解液B，涡旋震荡，待彻底混匀后，在20℃下水浴18min，使狂犬病毒颗粒充分彻底裂解。病毒裂解液A和狂犬病毒液的体积比为2:3；病毒裂解液B和狂犬病毒液的体积比为1:3。

裂解后的病毒液进行二次纯化，当区带离心转速达到3000rpm/min时，泵入病毒液、25%蔗糖、40%蔗糖和55%蔗糖，并加入PBS作为封闭液，进样完毕，再调节机器转速至25000rpm/min，离心0.5小时，收集病毒外膜片段部分。

在收集的病毒外膜片段部分中加入磷酸缓冲盐溶液至pH7.2，静置40min，经50KD滤膜超滤浓缩，透析脱糖后回收病毒外膜片段原液，即为狂犬病毒抗原。

3．动物免疫实验及病毒攻击保护实验：

将收集的狂犬病毒抗原与等体积油佐剂混合试制疫苗，在小白鼠上进行动物试验。0.5ml/只经肌肉或口服途径各免疫20只小白鼠，另设10只小白鼠不注射任何东西为对照组。一个月后，用致死性狂犬病毒cvs标准攻毒株经脑内攻击，结果试验组获得80%的保护，而对照组全部发病。

本实施例所制备的抗原无论注射还是口服的动物80-90%都产生保护性抗体。

实施例3

1.狂犬病毒裂解液及其配制方法：

裂解液A的配制：称取N-月桂酰肌氨酸钠8g、Triton X-100 3g、糖元18mg，加入无菌水定容至500ml，充分混匀溶解，使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至pH为6.5，高压灭菌10min；

裂解液B的配制：称取氯化钠4g、EDTA 6g，加入无菌水定容至500ml，充分混匀溶解，使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH为7.5，高压灭菌10min。

2.狂犬病毒裂解液的应用：

将Vero细胞于37℃培养，并经连续传4代。第4代细胞培养3-5天后，用磷酸缓冲液淋洗，接种病毒滴度为不低于7.5LgLD50/ml的狂犬病病毒固定毒CTN-1V株。并加入细胞维持液于35℃培养24小时。换入新鲜细胞维持液，按照上述条件继续培养2-4天，当细胞病变CPE达到++～+++时，收获、合并病毒液。按照1∶4000加入β-丙内酯，置于22℃、8天灭活病毒。经灭活试验验证合格后，用100KD滤膜超滤浓缩。于浓缩后的病毒液中加入10mg/ml的硫酸鱼精蛋白，使其终浓度为0.1mg/ml，8000rpm离心后，上清液除菌过滤，再经Sepharose4FF凝胶柱层析，收集得到纯化后的狂犬病病毒液。根据收集的纯化狂犬病病毒液体积，加入病毒裂解液A，涡旋震荡，待彻底混匀后，在10℃下水浴35min后，加入病毒裂解液B，涡旋震荡，待彻底混匀后，在18℃下水浴22min，使狂犬病毒颗粒充分彻底裂解。病毒裂解液A和狂犬病毒液的体积比为1.5:3；病毒裂解液B和狂犬病毒液的体积比为1.5:3。

裂解后的病毒液进行二次纯化，当区带离心转速达到3000rpm/min时，泵入病毒液、25%蔗糖、40%蔗糖和55%蔗糖，并加入PBS作为封闭液，进样完毕，再调节机器转速至25000rpm/min，离心0.6小时，收集病毒外膜片段部分。

在收集的病毒外膜片段部分中加入磷酸缓冲盐溶液至pH7.2,静置40min，经50KD滤膜超滤浓缩，透析脱糖后回收病毒外膜片段原液，即为狂犬病毒抗原。

3．动物免疫实验及病毒攻击保护实验：

将收集的狂犬病毒抗原与等体积油佐剂混合试制疫苗，在小白鼠上进行动物试验。0.5ml/只经肌肉或口服途径各免疫20只小白鼠，另设10只小白鼠不注射任何东西为对照组。一个月后，用致死性狂犬病毒cvs标准攻毒株经脑内攻击，结果试验组获得90%的保护，而对照组全部发病。

本实施例所制备的抗原无论注射还是口服的动物95-98%都产生保护性抗体。