PRV的基因组包括一个独特的长区序列(UL)和短区序列(US)，在US两侧存在着末端重复序列(TRR)和内部重复序列(IRS)。PRV基因根据它们所在的区域和发现的顺序命名，但也可根据其编码的蛋白命名。编码结构蛋白的基因包括位于US区的US2(28k)、US3(pk)、US4(gG)、US6(gD)、US7(gI)、US8(gE)、US9(11k)等和位于UL区的UL9(OBP)、UL27(gB)、UL22(gH)、UL23( TK)、UL44(gC)、衣壳蛋白基因、DNA多聚酶基因等。位于UL区的非结构蛋白基因包括能够与复制起点结合的UL9，编码DNA聚合酶的UL30，编码解旋酶的UL52以及参与转录调节的UL54等。US区也同样存在着一些非结构蛋白基因，包括编码膜蛋白的US9，膜蛋白的组成部分UL11和UL43。近年来，在基本完成PRV基因组各基因定位的基础上，对其各基因功能的研究己成为国内外学者研究的热点，尤其是一些病毒复制的非必须基因，如常见的毒力基因，缺失这些基因，病毒的毒力显著降低或消失，但仍然能刺激机体产生免疫力，这就为基因工程疫苗的研制奠定了基础。例如PRV最主要的毒力基因TK，它虽然与病毒的增殖无关，但其缺失不仅会引起病毒毒力极显著地降低，而且也使病毒在神经组织中的复制能力、从外周神经到脑的传播能力和引起脑炎致死的能力大大降低。因此缺失TK基因的PRV毒株被广泛地应用到PRV基因缺失疫苗的研究中。

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间质蛋白

间质层位于成熟病毒颗粒的衣壳和囊膜间，至少有14种间质蛋白是由病毒自身产生，但通常细胞的肌动蛋白也被整合到间质层中。间质蛋白在病毒进入细胞和病毒形态的形成中扮演着重要角色。若间质蛋白pUL37缺失，则PRV颗粒会严重受损，不能形成囊膜。若缺少间质蛋白pUL11，则病毒在细胞质中的形成受到抑制，其在RK-13细胞上形成的空斑明显减小。间质蛋白US3和UL13编码的蛋白激酶是病毒在轴突传导中的电位调节器，为病毒粒子在神经元细胞长距离传导提供稳定的保障。膜融合对于细胞的发育和有囊膜病毒的复制都是一个必要过程，疱疹病毒的复制过程包含着病毒囊膜和细胞膜明显的融合过程。在膜融合后，间质蛋白会随着衣壳进入细胞，并促进宿主细胞接收病毒。

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囊膜蛋白

疱疹病毒的糖蛋白几乎都能在病毒囊膜和其感染的细胞膜上发现。这些囊膜蛋白在病毒穿入、释放和细胞间的传播过程中起到重要作用。PRV的基因组共编码16个膜蛋白，11个膜蛋白是被O联或N联糖所修饰，分别命名为gB,gC,gD,gE,gG,gH,gI,gK,gL,gM和gN，还有4种蛋白没有被糖基化(UL20,UL43,US9,UL24)。UL34是一种2型膜蛋白，仅在初期的病毒颗粒中发现。在病毒进入细胞阶段，糖蛋白gC,gB,gD,gH和gL对病毒吸附宿主细胞和病毒囊膜与细胞膜的融合起着主要作用。作为病毒囊膜和病毒感染细胞的细胞膜成分，糖蛋白是宿主免疫系统识别的主要对象。gB基因是疱疹病毒成员中最保守的糖蛋白基因，gB蛋白的功能可以在不同的疱疹病毒之间相互取代，其能诱导动物产生补体依赖性抗体和不依赖补体的中和抗体，并且与合胞体的形成有着密切的关系。合胞体形成的关键是弗林蛋白酶裂解gB。gB虽然在病毒的穿入过程中扮演着重要角色，但其与病毒的释放无关系。gD是PRV必需的结构蛋白，是成熟病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，是一种受体蛋白，也是融合作用的触发器。当gD与细胞上的受体作用后，会发生构象变化，从而诱导gB、gH、gL形成具有多种用途的融合波群。gD是保护性抗体的主要目标抗原，试验证明，根据gD制备的单克隆抗体免疫小鼠后，能有效使小鼠产生很强的体液免疫。gE、gI并不是病毒增殖所必需的，但它们是PRV主要的毒力基因。当gE缺失后，PRV便无法入侵到动物的三级神经元。gI对病毒的体外培养有着一定的影响，会影响病毒从细胞中释放，当gI缺失时，病毒在细胞中形成的空斑可以减少85%。

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伪狂犬病疫苗的发展现状

5.1 弱毒疫苗

自然弱毒疫苗是通过非猪源细胞或鸡胚的反复传代或在某些诱变剂的存在下，高于通常的培养温度在细胞培养物上反复继代获得，其基因组的内部存在着多处点突变以自然及基因缺失，属于一种天然的基因缺失疫苗。在20世纪60年代后，许多国家用不同的方法培育了不少伪狂犬病弱毒疫苗株，如匈牙利的Bartha株、K61株、罗马尼亚的布加勒斯特株、TK200和BUK株、北爱尔兰的NFA-4株、法国的Alfolt-26株、保加利亚的MK25株、前苏联的VAGK-2株等。而目前应用较为广泛的主要有匈牙利的Bartha株、罗马尼亚的布加勒斯特株、BUK株等。

Bartha株是1961年匈牙利学者Bartha用猪源伪狂犬病强毒通过猪肾、鸡胚反复传代致弱的一个疫苗株。采用分子生物学方法对该疫苗株进行分析发现，疫苗株的基因组中存在多处突变。US区的整个gE和nK基因及部分91和28K片段缺失，UL区的gC基因信号序列存在点突变。由于该疫苗株的主要毒力基因TK没有缺失，因此与其它毒株相比，其存在一定的毒力。

布加勒斯特株(Bueharest)是罗马尼亚的布加勒斯特株兽医所将伪狂犬病强毒通过鸡胚尿囊膜培养继代至200代后，降低了其毒力，再用鸡胚培养后而制成的疫苗株。该疫苗株制成的冻干苗仅适用于9日龄以上的仔猪和妊娠2月龄的母猪，对兔、豚鼠和小鼠尚有较强的毒力。

BUK株是将1个Bucharest株通过鸡胚和鸡胚成纤维细胞继代800代以上获得的一个疫苗株。该疫苗株的毒力相比强毒株已大大减弱，对妊娠母猪和仔猪都有一定的免疫作用。

总的来说，虽然自然弱毒疫苗价格低廉，在伪狂犬病防制方面有着较强的免疫效果，但其主要毒力基因TK没有缺失，故其毒力返强的可能性很大，有可能导致疫病的流行，而且未经充分致弱或过度致弱的疫苗株不仅不能诱导满意的免疫保护反应，反而有可能引起疫病及免疫抑制。弱毒疫苗还可导致潜伏感染，存在散毒的可能，在部分接种的猪血清中虽然存在中和抗体，但其排毒期却可持续数年。因此许多国家已禁止使用弱毒疫苗，而以TK基因缺失的基因缺失疫苗取代。

5.2 亚单位疫苗研究进展

亚单位疫苗是将PRV保护性抗原基因在原核或真核系统中表达所获得的产物制成的疫苗。它具有许多优点:（1）安全性好，疫苗中不含任何病原微生物，接种动物后不会发生急性、持续或潜伏感染，可用于不宜使用活疫苗的情况，如妊娠动物。（2）可以减少或消除常规活疫苗或灭活疫苗难以避免的热原、变应原、免疫抑制原或其他有害的反应原。（3）疫苗稳定性好，便于保存和运输。（4）产生的免疫应答可以与野毒感染所产生的应答相区分，有利于疫病的控制和消灭。（5）可以大量生产。

目前，在己发现的伪狂犬病病毒的11种糖蛋白中，gB、gC、gD均能诱导机体产生中和抗体。在没有补体的参与下， gB、gC、gD的单克隆抗体均能中和PRV。小鼠和猪注射gB、gC、gD的单克隆抗体后均能抵抗PRV强毒的攻击。因此， gB、gC、gD是研制PRV亚单位疫苗的首选蛋白。Marchioli等将PRV保护性抗原基因gD克隆到PSVZdhfr载体的人巨细胞病毒(hCMV)启动子的下游，然后转入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中，经氨喋呤筛选出1株表达糖蛋白gD的CHOgD-17细胞株，经大量培养后用表达产物配以佐剂，鼻内接种免疫猪，能诱导猪产生中和抗体并保护猪抵抗PRV强毒的攻击。杆状病毒表达的PRV糖蛋白gC能诱导小鼠产生中和抗体。

Tulman等将提取的PRV囊膜蛋白gC制成免疫源复合物即亚单位疫苗。用亚单位疫苗免疫小鼠和猪，均能够诱导抗体应答和淋巴细胞增殖反应。用此亚单位疫苗免疫小鼠和猪，均能够诱导抗体应答和淋巴细胞增殖反应。用此亚单位疫苗免疫两次，能够保护小鼠免受致死量的PRV强毒的攻击。

5.3核酸疫苗研究进展

DNA疫苗最大的优点是能克服伪狂犬病病毒的潜伏感染，而且能激发细胞免疫，因此受到人们的青睐，同时其具有操作简单、成本低廉和安全等特点，颇具开发潜力。自上世纪90年代DNA疫苗诞生后，人们在对其免疫机理、免疫方法、途径及免疫佐剂等进行积极研究的同时，不断地认真审视和研究DNA免疫可能存在的缺陷，如免疫后能否产生抗DNA抗体、免疫耐受或超免反应以及是否会导致宿主细胞恶性转化等。其中，人们最为关注的是DNA疫苗能否导致宿主细胞恶性转化，这也是DNA疫苗难以应用于临床的最大障碍。Manam等的研究结果表明肌肉注射DNA疫苗不存在疫苗DNA整合入宿主细胞基因组或引起基因突变的可能。伪狂犬病毒DNA疫苗试验结果表明，核酸疫苗不仅可以诱发体液免疫，也可产生细胞免疫，而且保护时期较长，有的可达一年以上。1996年，Montail等构建了PRV gD基因(由I型腺病毒晚期启动子控制)的真核表达质粒，以其接种仔猪，结果显示未曾免疫过的仔猪和经过加强免疫的仔猪能够产生中等水平的中和抗体。Gerdts等将 PRV的gC或gD基因置于人巨细胞病毒的主要立即早期启动子的控制下构建了DNA疫苗。

用表达gC的核酸疫苗免疫能完全保护猪抵抗PRV75VI9毒株的致死性攻击，并能保护猪部分抵抗PRV强毒MA-3株的攻击；但用表达gD的核酸疫苗免疫却不能保护猪抵抗PRV强毒株的攻击。用1Lg的gC核酸疫苗肌肉或皮下免疫接种3次，能够部分保护猪抵抗NIA-3毒株致死性攻击。免疫后特异性抗体至少能持续9个月以上。van Rooij等用含PRV-gB 、gC或gD基因的DNA疫苗免疫猪，含PRV-gB基因的DNA疫苗能诱导最强的细胞免疫应答(包括细胞毒性T细胞应答)，而含PRV-gD基因的DNA疫苗却能诱导最强的中和抗体应答。同时前者能减少攻毒猪的排毒时间，而PRV-gC或gD基因的DNA疫苗却不能。2001年，Shiau等以大肠杆菌为载体将含有PRV-gD基因的DNA疫苗免疫小鼠，小鼠能产生特异性抗体应答并能抵抗PRV强毒的攻击。若与含A-胸腺素原基因的DNA疫苗同时免疫，则表现为协同作用，能增强细胞免疫应答。Shiau等2001年进一步用含PRV-gD基因的猪霍乱沙门氏菌弱毒株进行口服免疫小鼠，发现小鼠能产生抵抗PRV强毒攻击的免疫应答。若与含A-胸腺素原基因的猪霍乱沙门氏菌弱毒株同时免疫，则能提高疫苗的免疫效果。

研发部 董金杰

审稿李永霞

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