活性污泥膨胀现象普遍存在于世界各国污水处理厂, 其特征主要体现为污泥沉降性能变差、出水水质恶化, 情况严重时会导致活性污泥处理系统的瘫痪[1, 2].活性污泥膨胀这一难题已经困扰了学界多年.现有的研究表明, 丝状菌过度增殖是引起污泥膨胀的主要原因.膨胀污泥中的丝状菌种类十分繁杂, 在生物分类学中归属于原核生物域和真核生物域.前者主要来自放线菌门(Actinobacteria), 包括戈登氏菌属(Gordonia)[3]、微丝菌(Microthrix parvicella)[3, 4, 5]、偶发分支杆菌(Mycobacterium fortuitum)[3, 6]等; 变形菌门(Proteobacteria), 例如丝硫细菌属(Thiothrix)[7]、浮游球衣菌(Sphaerotilus natans)[8]; 绿弯菌门(Chloroflexi), 例如Type0092[9]、Type1851[10]; 以及拟杆菌门(Bacteroidetes), 例如软发菌(Haliscomenobacter hydrossis)[11]和噬胞菌属(Cytophaga)的1863类型[3].真核生物域的丝状菌都是真菌, 但对它们的了解十分有限.迄今为止仅分离鉴定出青霉菌属(Penicillum)[12]、镰刀菌属(Fusarium)[13]等几株真菌.

活性污泥膨胀与水质、温度、营养状况以及工艺运行条件都有关系[1, 13].各种丝状菌对营养物质的利用情况不同, 对pH、温度和盐类的适应性也有差异[14].这方面现有的研究主要集中在Type021N、Type1851、微丝菌和诺卡氏型菌属(Nocardioforms)[15~17]这些细菌上, 而对膨胀污泥中的丝状真菌特性研究几乎是空白.

传统的分离培养方法对于膨胀污泥中丝状菌的鉴定必不可少, 但也存在弊端：很多丝状菌的形态都十分相似, 还有些丝状菌的形态会随外界条件的改变而变化(例如浮游球衣菌、Type1701、Type0092、Type0961)[18, 19], 因此仅依靠形态学分析就非常容易误判.此外, 大量丝状菌是难以培养或无法培养的, 只有通过非培养法才能获知其核酸信息. PCR-DGGE是最常用的分析技术, 但操作繁琐, 且容易丢失样品中含量较低微生物的信息, 也无法对各物种进行准确的丰度计算[20].近年来迅速发展起来的高通量测序技术, 具有分析结果准确、高速、高灵敏度和高自动化等特点, 能够对样品中所有微生物进行全面检测, 在海量数据的基础上对各物种的种类和丰度进行分析, 在环境微生物鉴定领域的应用越来越广泛[21, 22].

本研究尝试将传统的分离培养与分子生物学技术相结合, 对膨胀活性污泥中的丝状菌进行分离鉴定, 尤其针对以往不曾探明的丝状真菌进行深入研究.考察菌株对不同碳源的利用情况以及温度、pH和盐分等环境因素对菌株生长的影响.在高通量测序的基础上, 全面分析膨胀污泥中微生物的群落结构, 以期为阐明活性污泥膨胀成因提供科学依据.

2015年3月~2015年4月, 从西安市某污水处理厂A2/O工艺好氧池采集膨胀活性污泥共7次.采集的膨胀污泥用冰盒保存, 2 h内送至实验室进行污泥沉降指数(SVI)分析和丝状菌培养.膨胀污泥经10倍稀释后取0.1 mL分别涂布于高氏一号培养平板(淀粉20 g, KNO3 1 g, NaCl 0.5 g, K2HPO4 0.5 g, MgSO4 0.5 g, FeSO4 0.01 g, 琼脂20 g, 水1 000 mL, pH 7.2~7.4) 和添加K2CrO7的淀粉培养平板(牛肉膏5 g, 蛋白胨10 g, NaCl 5 g, 可溶性淀粉2 g, 琼脂20 g, K2CrO7 50 mg, 水1 000 mL, pH 7.0~7.2) 表面, 置于28℃培养4~7 d, 挑取单菌落分别在高氏一号培养平板和淀粉培养平板上进行分离纯化.

将分离出的菌株插片培养3~5 d, 经革兰氏染色和奈氏染色, 于光学显微镜下观察菌株的形态特征.

在95℃裂解菌株, 释放DNA作为模板进行PCR扩增.分别使用细菌引物(968F和1401R)、真菌引物(NS1和Fung)和放线菌引物(243F和513R), 对丝状菌进行鉴定(表 1).反应体系体积为25 μL, 主要包括2 μL DNA, 0.25 μL Taq酶(大连宝生物有限公司), 2.5 μL 10×Buffer, 2 μL dNTP, 400 nmol·L-1引物.采用ABI VeritiTM热循环仪(Applied Biosystems, USA)进行PCR扩增, 反应程序为：95℃ 5 min, 95℃ 30 s, 60℃ 45 s, 72℃ 1 min, 共35个循环, 最后72℃延伸5 min.将扩增产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析, 测序结果在NCBI的GenBank数据库上进行BLAST比对分析, 确定丝状菌的类型.

对分离得到的具有发达菌丝体的丝状菌分别进行牛奶胨化和液化检测、硝酸盐还原检测以及黑色素产生检测.

(1) 牛奶胨化和液化检测

将菌株接种于脱脂牛奶中, 于28℃培养, 分别于3、6、10、20和30 d进行观察, 若发现牛奶凝结即产生胨化, 进一步培养观察是否使蛋白质发生水解产生液化现象.

(2) 硝酸盐还原检测

将菌种接种于硝酸盐培养基中(KNO3 1 g·L-1, K2HPO4 0.5 g·L-1, NaCl 0.5 g·L-1, MgSO4 0.5 g·L-1, 蔗糖20 g·L-1, 琼脂粉17 g·L-1, pH 7.2~7.4), 于28℃下倒置培养5 d.加入1:1的磺胺酸冰醋酸溶液和α-萘胺乙醇溶液试液200 μL, 10 min后观察, 溶液呈红色为阳性, 无色则为阴性.

(3) 黑色素产生检测

将菌株接种于培养基中(酪氨酸1 g·L-1, 酵母提取物1 g·L-1, NaCl 0.5 g·L-1, 琼脂粉17 g·L-1, pH 7.2~7.4), 观察黑色素的产生.

选用分离得到的毛孢子菌属(Trichosporon)、链霉菌属(Streptomyces)、青霉菌属(Penicillium)、链格孢属(Alternaria)的4株菌作为典型菌株, 进行下列试验：

(1) 环境因素影响试验

将菌液均匀涂布到淀粉培养基(pH=7) 表面, 分别在10℃和28℃条件下培养, 利用菌落计数仪(Czone G6T, 杭州迅数科技有限公司)测量菌落直径的大小, 判定温度对菌株生长的影响.调节淀粉培养基的pH(5、7、9)、NaCl的浓度(0、5、25、50 g·L-1), 在28℃条件下培养, 分析pH和盐度对菌落生长的影响.

(2) 碳源利用试验

将葡萄糖、蔗糖、纤维素分别作为碳源按1:1浓度加入到碳源利用培养基(NH4)2SO4 2.64 g·L-1, KH2PO4 0.5 g·L-1, K2HPO4 0.5 g·L-1, MgSO4·H2O 0.5 g·L-1, CuSO4·5H2O 0.006 4 g·L-1, FeSO4·7H2O 0.001 1 g·L-1, MnCl2·4H2O 0.007 9 g·L-1, ZnSO4·7H2O 0.001 5 g·L-1, 琼脂粉15.0 g·L-1, pH 7.2~7.4) 中, 将菌株分别接种于不同碳源浓度(400 mg·L-1、1 000 mg·L-1、2 000 mg·L-1)的培养基中, 28℃培养10 d, 于离心管中3 000 r·min-1离心10 min, 105℃干燥烘干, 测定丝状体的重量.

采用土壤DNA提取试剂盒(MoBio, USA)提取膨胀污泥总DNA, 通过Illumina Miseq平台分别进行16S rDNA和rDNA-ITS区高通量测序, 过滤掉嵌合体, 去除引物、条形码和非靶位序列, 在0.97相似度下进行聚类, 得到操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs).通过物种注释, 进而分析膨胀污泥中原核生物和真菌的群落结构.

所有批次膨胀污泥样品的SVI范围为193~249 mL·g-1, 污泥沉降性能很差[26].从革兰氏染色后的显微镜检照片可以看出, 污泥中存在大量呈革兰氏阳性的丝状体(图 1).

在高氏一号培养基和淀粉培养基上, 丝状菌出现总频次分别为25和50, 共有40种不同的形态.通过核酸序列比对, 鉴定出来的丝状菌可归为18个属.除链霉菌属和细杆菌属(Microbacterium)属于细菌域的放线菌门, 其它都隶属于真菌域的子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota).在高氏一号培养基上, 青霉菌属(4/25)、枝孢菌属(Cladosporium)(3/25)、链霉菌属(3/25)、链格孢属(2/25) 的出现频次较高, 合计占总频次的60%;而在淀粉培养基上, 枝孢属(7/50)、细杆菌属(6/50)、曲霉菌属(Aspergillus)(4/50)、青霉菌属(3/50)、Ophiodothella (4/50)、毛孢子菌属(3/50)、Neolinocarpon(3/50) 出现频次较高, 占比均在5%以上(表 2).淀粉培养基较高氏一号培养基分离得到的丝状菌种类更多.

以往的研究表明, 真菌作为菌胶团的骨架, 具有增强活性污泥的沉淀性能、脱水性能以及降解有害物质的作用[27], 其中青霉菌属是活性污泥中最主要的真菌, 其次为毛孢子菌属、曲霉菌属以及枝孢菌属[28, 29].从本研究分离鉴定的结果来看, 膨胀活性污泥中不仅有这几种主要的真菌, 还存在一些不常见的丝状真菌, 例如半乳糖霉菌(Galactomyces)、Ophiodothella和Neolinocarpon等.

从高氏一号培养基和淀粉培养基上分离出的丝状菌, 这些丝状菌大部分具有发达的基内菌丝或气生菌丝, 其中青霉菌和毛孢子菌存在明显孢子.但在菌落形态和显微结构上具有明显差别.

高氏一号培养基上生长的枝孢菌的菌落比较干燥, 呈圆形, 有白色的气生菌丝和褐色的基内菌丝, 菌丝分枝少[图 2(a)].青霉菌的菌落不规则、较松散、干燥、覆着面较广, 有绿色基内菌丝和白色气生菌丝, 菌丝较粗且弯曲[图 2(b)].链格孢菌的菌落呈灰黑色、干燥、有绒毛、生长旺盛, 菌丝多而细、稍有弯曲且分枝多[图 2(c)].链霉菌的菌落为白色圆形、表面较干燥且凸起, 菌丝密集、短而弯曲[图 2(d)].

淀粉培养基上生长的毛孢子菌具有黄色圆形菌落, 表面较干燥, 有浓密的基内菌丝, 其孢子呈圆形、串珠状[图 3(a)].淀粉培养基中生长的枝孢菌, 其菌落特征和显微形态都与高氏一号培养基上的枝孢菌大相径庭, 该菌落呈黑色圆形, 与培养基结合紧密, 菌丝浓密, 细长且弯曲[图 3(c)].细杆菌为革兰氏阳性, 在淀粉培养基上形成淡黄色菌落[图 3(d)].

具有发达基内菌丝或气生菌丝菌株的生理生化特性如表 3所示.枝孢菌、Wojnowicia、链霉菌属菌株Ⅱ、曲霉菌、毛孢子菌、Neolinocarpon和细杆菌能够以硝酸盐作为电子受体, 将硝酸盐还原为亚硝酸盐, 而其他菌株均不具有硝酸盐还原功能.青霉菌属菌株Ⅰ和菌株Ⅱ生化特性相同, 但链霉菌属菌株Ⅰ和菌株Ⅱ却有不同的生化特性, 枝孢属菌株Ⅰ和菌株Ⅱ之间也存在这种情况(表 3).这说明隶属于同一菌属的不同菌株, 其生化特性可能会有较大差别.

毛孢子菌、链霉菌、青霉菌、链格孢菌均可在28℃下生长, 但生长速度差异明显.毛孢子菌生长较快, 28℃培养36 h即有肉眼可见的菌落生成, 青霉菌、链格孢菌在44 h出现菌落, 而链霉菌则在68 h才长出菌落.在10℃培养, 这4种丝状菌均无法良好生长, 可见低温能够在一定程度上抑制丝状菌的生长.

在各种pH条件下, 链格孢菌形成的菌落直径最大, 而链霉菌的菌落直径最小.在中性(pH=7) 和偏酸性(pH=5) 的条件下, 毛孢子菌、链霉菌、青霉菌、链格孢菌均能良好生长, 但在偏碱性(pH=9) 环境中生长状况较差(图 4).导致活性污泥膨胀的原因很复杂, pH是重要的因素.有研究表明, 活性污泥菌胶团适宜生长的pH约为6~8, 偏酸性环境(pH=5~6) 容易诱发丝状菌生长[30].然而, 从本研究的结果来看, 丝状菌并非总在偏酸性环境下大量生长, 中性条件同样适于丝状菌的增殖.调节污泥pH呈偏碱性, 能够抑制丝状菌的生长.

所选的4种典型丝状菌均能在低盐度条件下(5 g·L-1 NaCl)良好生长, 而在高盐度条件下(25 g·L-1、50 g·L-1 NaCl), 毛孢子菌、链霉菌的生长均受到抑制, 但青霉菌和链格孢菌的菌落生长受制情况并不显著, 甚至在长时间培养后反而呈现出更好的生长态势.例如经92 h培养, 在50 g·L-1 NaCl条件下的青霉菌形成的菌落直径约为7 mm, 超过了低盐度条件和无NaCl条件下的.这说明某些丝状菌具有很强的耐盐性, 在高盐环境中长时间培养后仍可良好生长(图 5).在污水处理厂的运行实践中, 常用投加NaCl来抑制活性污泥膨胀.然而, 从本研究的结果来看, 此法并非对所有丝状菌有通用的抑制效果, 且作用效果受时间的影响很大.另外考虑到高盐度会抑制大多数细菌的生长和活性, 故从长期运行来看, 仅通过提高盐度来控制污泥膨胀并不值得推荐.

在分别添加了蔗糖、淀粉和纤维素的培养基中, 毛孢子菌均无明显生长.但链霉菌、青霉菌Ⅰ、链格孢菌则可有效地利用上述3种碳源, 都生长出较多菌丝.在添加蔗糖的培养基中, 链霉菌、青霉菌、链格孢菌的菌丝干重明显高于添加其他两种碳源的培养基, 且都随着碳源浓度升高而增加.在相同碳源种类和浓度条件下, 链格孢菌的菌丝干重远超链霉菌和青霉菌(图 6).

采用高通量测得膨胀污泥样品细菌群落概貌如图 7所示.膨胀污泥样品OTUs数量为1583个, 变形菌门(32.25%)、拟杆菌门(25.24%)是膨胀污泥中最主要的两大门类[31], 在所有细菌中的占比大约为57.6%, 此外还有一些细菌域的古老细菌, 例如绿弯菌门(2.91%)、绿菌门(Chlorobi)(2.55%)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)(4.35%)以及待定分类门TM7(4.66%)等.从属分类水平来看, 各个属的占比都比较低, 数量最多的前20个属占比总和仅有18.7%(图 7), 膨胀污泥中微生物种类极其多样, 且在生物分类单元上的分布非常分散.虽然存在微丝菌属(Microthrix), 但其含量很低(0.25%), 不足以导致污泥膨胀.结合污泥显微镜检照片来分析, 可以推断该污泥膨胀并不能归咎于微丝菌, 丝状菌的大量繁殖可能是主要原因.

膨胀污泥样品rDNA-ITS区高通量测序得到300个OUTs.在门分类水平上, 子囊菌门、担子菌门和接合菌门(Zygomycota)的占比分别为0.74%、0.19%和0.01%.从属分类水平上看, 酵母菌属(Saccharomyces)(0.43%)、毛孢子菌属(0.11%)、枝顶孢属(Acremonium)(0.06%)、念珠菌属(Candida)(0.04%)和青霉菌属(0.02%)都属于相对较多的真菌(图 8).值得注意的是, 鉴定出类别归属的真菌仅占非常小的比例, 绝大部分OTUs无法与已知的真菌类别相对应.有高达98.8%的真菌不属于已知的任何门类, 排名前20个属的真菌占比总和还不足1%.由此可见, 人类目前对真菌的了解还非常有限, 现有真菌数据库与自然界的真菌种类相比存在巨大的差距.膨胀污泥中真菌种类十分丰富, 存在大量未知真菌.未来的研究应更多关注膨胀污泥中的真菌多样性及典型真菌的特性.

(1) 利用高氏一号培养基和淀粉培养基从膨胀污泥中分离鉴定出18个属的丝状菌, 其中链霉菌、细杆菌属于细菌域放线菌门, 其余均为真菌.青霉菌、枝孢菌、链格孢菌、曲霉菌、毛孢子菌在培养基上出现频次较高.膨胀污泥中存在半乳糖霉菌、Ophiodothella和Neolinocarpon等不常见的丝状真菌, 并可被分离培养出来.

(2) 在中性和偏酸性条件下, 毛孢子菌、链霉菌、青霉菌、链格孢菌都能良好生长.高浓度的NaCl能够抑制毛孢子菌和链霉菌的生长, 但对青霉菌和链格孢菌的抑制作用却不明显.链霉菌、青霉菌和链格孢菌可利用蔗糖、淀粉和纤维素这3种碳源, 碳源浓度增加会促进它们的生长.

(3) 基于rDNA-ITS区的高通量测序结果表明膨胀污泥中的真菌种类十分丰富, 但已知菌属所占比例极小, 存在大量的未知真菌.未来的研究应更多关注膨胀污泥中的真菌多样性及典型真菌的特性.