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以下方案描述了
贴壁培养哺乳动物细胞传代的一般流程。请注意昆虫细胞与哺乳动物细胞传代的一些关键步骤有所不同。有关详细信息，请参阅
昆虫细胞传代培养注意事项。
要传代您自己的细胞系，我们建议您严格按照实验中使用的每种产品随附的说明进行传代。偏离特定细胞类型所需的培养条件可能导致表达异常表型，甚至细胞培养完全失败。 材料 含有贴壁细胞的培养容器组织培养处理过的培养瓶、培养板或培养皿完全生长培养基，预热至 37°C15 mL 一次性无菌管含 5% CO2 湿润空气的 37°C 培养箱平衡盐溶液，如 Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (DPBS)，不含钙、镁或酚红解离试剂，如胰蛋白酶或 Gibco TrypLE Express，不含酚红用于确定活细胞和总细胞计数的试剂和设备（例如 Countess II FL 自动细胞计数仪、台盼蓝和血细胞计数器或 Coulter Counter® (Beckman Coulter)）14190144,15400054,15090046,12604013,15250061,AMQAF1000,AMQAX1000贴壁细胞传代方案 视频：细胞传代本视频解释了为什么、何时以及如何在贴壁培养物和悬浮培养物中传代细胞。这包括细胞解离、细胞计数、确定最佳接种密度和为传代细胞准备新的培养容器。 与细胞直接接触的所有溶液和设备都必须无菌。始终使用适当的无菌技术，并在生物安全柜中进行操作。 从培养容器中取出并丢弃用过的细胞培养基。用不含钙和镁的平衡盐溶液清洗细胞（每 10 cm2 培养表面积约 2 mL）。向培养容器附着细胞层的对侧缓慢添加洗涤液，以避免干扰细胞层，并来回摇动数次培养容器。注：洗涤步骤会去除任何抑制试剂解离作用的痕量血清、钙和镁。 从培养容器中取出并丢弃洗涤液将预热的解离试剂（如胰蛋白酶或 TrypLE）添加到培养瓶一侧；使用足够的试剂覆盖细胞层（每 10 cm2 约 0.5 mL）。轻轻晃动容器，以完全覆盖细胞层。室温孵育培养容器约2分钟。请注意，实际孵育时间因使用的细胞系而异。在显微镜下观察细胞是否解离。如果细胞解离率低于 90%，则将孵育时间延长几分钟，每30秒检查一次分离情况。您也可以轻敲容器以加快细胞解离。当≥ 90%的细胞已解离时，倾斜培养容器一小段时间，使细胞排出。加入相当于2倍体积（所用解离试剂体积的两倍）的预热完全生长培养基。通过几次移液，从细胞层表面分离培养基。将细胞转移至 15 mL 锥形管中，然后以 200 × g 离心 5-10 分钟。请注意，离心速度和时间因细胞类型而异。将细胞团块重悬于最小体积的预热完全生长培养基中，并取出样本进行计数。利用血细胞计数器、细胞计数仪和台盼蓝拒染法或 Invitrogen Countess 自动细胞计数仪测定细胞总数和活细胞百分比。如有必要，向细胞中加入生长培养基，以达到所需的细胞浓度，并重新进行细胞计数。注：我们建议使用 Countess 自动细胞计数仪测定细胞总数和活细胞百分比。Countess 自动细胞计数仪使用与您当前使用的血细胞计数器相同的样本量，对于典型的细胞计数，每份样本只需不到一分钟的时间，并且与各种真核细胞兼容。请参阅利用血细胞计数器进行细胞计数的方案。 将细胞悬浮液稀释至细胞系的推荐接种密度，并将适当体积的细胞移液至新的细胞培养容器中，然后将细胞放回培养箱。注：如果使用培养瓶，在将其放回培养箱之前，如您使用的不是带透气盖的透气培养瓶，请先打开瓶盖，以便进行适当的气体交换。 昆虫贴壁细胞传代注意事项尽管昆虫细胞传代培养的一般步骤与哺乳动物细胞相同，但这些培养体系的一些关键要求不尽相同。为获得最佳结果，请务必按照您实验中使用的每种产品随附的说明进行操作。 昆虫细胞在对数期传代。然而，如果您的昆虫细胞贴壁能力很强，您可在其达到汇合状态或刚刚脱离培养瓶底部时进行传代，此时细胞将更容易脱落。细胞密度低于汇合状态的 20% 时，生长会受到抑制。最健康的细胞是取自对数期培养物中的细胞。不建议在昆虫细胞培养中进行 CO2 交换。将昆虫细胞保存在 27°C 的非湿润环境中。可将细胞避光保存在室温条件下的试验台上或抽屉里。但是，还是推荐27°C的受控环境进行培养。使用专门为昆虫细胞生长配制的培养基。在无血清条件下，昆虫细胞非常紧密地附着在基质上，需要额外的力才能解离。要使这些细胞脱离，您可能需要借助手腕的快速运动来摇动培养瓶。为避免污染，在执行此步骤前请务必拧紧瓶盖。注意：我们不建议剧烈摇动培养瓶，因为这可能会导致细胞损伤。 返回 Gibco 细胞培养基础知识主页 |
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