橙皮苷的分离纯化与分析测定

一、             实验目的与要求

1．掌握黄酮苷类的提取分离方法;

2．掌握用HPLC定量测定橙皮苷的操作方法。

二、             基本原理

橙皮苷（又称陈皮苷或桔皮苷）临床上常作为治疗高血压的辅助药和止血药。能维持血管正常渗透压，减低血管脆性，缩短流血时间，具有类似维生素P作用；其复合剂也用于治疗类风湿性关节炎和风湿热。橙皮苷在许多国家已成为法定药物。新橙皮苷、柚皮苷（又称柚苷、柑桔苷或异橙皮苷）具有和橙皮苷类似的药理作用,但它们结构均不相同。柚皮苷为一新型甜味剂。因此,发掘该类成分的资源和进行深加工具有重要意义。

我国柑桔栽培面积居世界，产量居世界第三位(柑桔皮重约占整果重20%，含有丰富的香精油、色素、果胶、橙皮苷等。近年国内果品产量大幅度提高，柑桔国内年产数千万吨，收获季节常造成大量积压，价格很低。柑桔除食用外，还可及时进行各种深加工、综合利用，既减少了果农损失，又可提高其经济价值。柑桔经过加工可提取果汁，制备固体饮料、桔子汽水、桔子酒、果冻、果酱等，从柑桔皮中也可提取柑桔精油、色素、果胶和橙皮苷。此外还可制作果丹皮、桔子饼、药用品等以及植物性农药等。柑桔落果、裂果约占柑桔总产量的10%左右，其橙皮苷含量十分丰富。随品种和产地的不同，一般干果的橙皮苷含量约在百分之几至百分之十几。另外柑桔皮除入药外，有相当部分的桔皮未做任何处理便丢弃掉，是一种生物资源的很大浪费。因此以柑桔落果或柑桔皮为原料，提取橙皮苷可成为橙皮苷生产的重要途径之一。

R1

R2

R3

OCH3

OH

H

橙皮素

OH

H

H

柚皮素

OCH3

OH

-O-glc6-1rham

橙皮苷

OCH3

OH

-O-glc2-1rham

新橙皮苷

OH

H

-O-glc6-1rham

柚皮苷

橙皮苷及其类似物的结构

橙皮苷（又称陈皮苷或桔皮苷）为二氢黄酮苷类化合物，是橙皮素与葡萄糖和鼠李糖结合形成的苷类，为细树枝状针状结晶(pH6-7沉淀所得)。Mp.258-2620C(2500C软化)。［α］20 D-760（C=2，吡啶）。在水中溶解度为1：50000，600C时溶解于二甲基甲酰胺及甲酰胺。略溶于甲醇及热冰醋酸，几乎不溶于丙酮、苯及氯仿，易溶于稀碱及吡啶。

根据黄酮类化合物的结构与性质，通常用溶剂法和碱溶酸沉法提取,再利用其它方法进一步精制。溶剂法中一般多用水或乙醇为溶剂，加热提取，提取液再用乙酸乙酯、乙醚等萃取，除去杂质。碱提取酸沉淀法则是利用黄酮类一般易溶于碱水、酸化后又可沉淀析出的原理提取分离。此法简便易行。如从槐米中提取芦丁(rutin)，从黄芩提取黄芩苷均可用此法。但所用酸碱均不宜过浓过强，以免强碱在加热时破坏黄酮，也防止在酸化时生成钅羊盐，使析出的黄酮又复溶解，影响收得率。当材料含有大量果胶、粘液等水溶性杂质时，宜用石灰乳或石灰水代替碱性水液提取，以使含羧基杂质沉淀，不致溶出。这样有利于后续纯化处理。

本试验以柑桔落果或柑桔皮为原料来提取橙皮苷。对橙皮苷的定量分析有库仑滴定法、紫外分光光度法、薄层扫描法和高效液相色谱法。本实验原材料和精制橙皮苷中橙皮苷经薄层鉴定后，其含量是用薄层扫描法和高效液相色谱法测定的。

三、             仪器与试剂

1．仪器：烧杯，容量瓶，硅胶薄层板，聚酰胺薄膜，滤纸，抽滤装置，紫外灯，层析缸，双波长薄层扫描仪，薄层扫描仪，荧光分光光度计，高效液相色谱仪等

2．样品与试剂：柑桔落果（或柑桔皮），饱和石灰水，盐酸，槐米，硼砂，石灰乳，55％乙醇，55％乙醇(内含2%KOH)，50%DMF溶液，橙皮苷标准品，甲醇，1％AlCl3甲醇液，硅胶G，正丁醇∶冰醋酸∶水(4∶1∶1)

四、             实验内容与步骤

将收集来的柑桔落果（或柑桔皮）进行除杂，切片，低温干燥后，粉碎。

方法一将提取果胶之后的柑桔皮粉残渣100g置1000 mL烧杯中,加水450 mL浸泡，再加入6-8g 1：1生熟石灰混合粉［2］，慢速搅拌下浸提1h,在此期间调节保持pH值为11-12，过滤。滤渣再次用400 mL水浸泡1h，过滤，合并两次滤液。用盐酸调节滤液pH值为4.5-5.0，在室温下静置过夜，使橙皮苷沉淀完全，滤取沉淀，用热水洗涤沉淀几次，干燥得粗橙皮苷。称重，计算收率。

方法二 将100g柑桔落果粉置1000 mL烧杯中，用600 mL的饱和石灰水,在搅拌下加热煮沸0.5h，在此期间用少量石灰乳调节，使pH保持-13。过滤。滤渣再次用400 mL饱和石灰水加热提取1次。合并滤液，用HCl中和至pH4-5，热至60-70℃，并保温30 min，冷却静置1.5h，使其沉淀完全，过滤，收集固体，并用热水洗涤，60-70℃干燥，即得淡黄色粗橙皮苷。

方法三 将100g柑桔落果粉置1000 mL烧杯中，用800 mL的饱和石灰水常温下(20℃)搅拌浸提1.5h，在此期间适当添加少量石灰乳，使pH保持为11-12。过滤，滤渣再次用400 mL饱和石灰水搅拌浸提1h。合并滤液，用HCl中和至pH4-5，热至60-70℃，并保温15 min，冷却静置1.5h，使其沉淀完全，过滤，收集固体，并用热水洗涤，60-70℃干燥，即得淡黄色粗橙皮苷。

方法四 取橙皮粗粉100g，加300 mL55％乙醇回流提取1.5h，过滤。残渣再用200 mL提取1次。合并滤液，减压蒸馏回收乙醇,至总体积1／2。趁热过滤，滤后静置2h，待其沉淀完全。过滤得沉淀物，少量水洗后，低温下干燥得粗制橙皮苷，称重，计算收率。

方法一 加55％乙醇(内含2%KOH)碱性溶液溶解,滤除不溶物，滤液加稀HCl中和，析出沉淀，收集后用适量乙醇重结晶，得橙皮苷白色结晶。称重，计算产率。

方法二将粗橙皮苷置于50%DMF溶液中，在50-600C下加热回流，趁热过滤,滤液静置12h，析出晶体，过滤，将晶体在600C下烘干，即可得淡白色纯品，称重，计算产率。

仪器及测试条件: 岛津CS-910型双波长薄层扫描仪；反射法锯齿形扫描，λS =280nm，λR=400nm；扫描速率20 mm/min，纸速20 mm/min，狭缝1.25 mm×1.25 mm，记录仪灵敏度×1，散射参数SX为3。

标准曲线绘制：取橙皮苷标准品配成0.50 mg/ mL甲醇标准溶液，精密吸取2.00-10.00μL一系列标准液，分别点于硅胶G薄层板上，展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶水(4∶1∶1)，饱和半小时后上行法展开，挥干溶剂，即在365nm紫外灯下定位，按上述仪器条件测定，以标准品浓度对其积分值作标准曲线，并得回归方程为[3]：Y＝0.0436X+0.0258，ｒ＝0.998.

样液制备［4］：精密称取原料样品粉末0.1000-0.5000g，用20 mL甲醇在800C水浴中超声波萃取30 min,小心转移提取液，残渣用15 mL甲醇在800C水浴中超声波再萃取1次，过滤，少量甲醇洗残渣，合并滤液定容至50 mL。如果测定精制品中橙皮苷含量,则需称取精制品0.02-0.01g,用15 mL甲醇在800C水浴中超声波促溶30 min,然后定容至50 mL即可。

样液测定[5]： 精确吸此甲醇液6.00μL，标准液3.00μL、5.00μL，分别点于板上，同前操作并扫描，用外标二点法求橙皮苷含量。计算公式如下：

(M1+M2)×Ax/2

Mx＝ -----------------

(A1+A2)/2

M1,M2分别为标准液3.00μL，5.00μL中含橙皮苷毫克数，Ａ1，Ａ2分别为其液点相应积分值。Ａx为供试品斑点积分值.

样品中橙皮苷百分含量(%)＝(Mx/6.00×5 0×1000)/[(0.1-0.5)×１０５]

本法加样回收率为99.5%，CV3.8%

仪器条件：CS-930薄层扫描仪(日本岛津)，MPE-4-型荧光分光光度计(日本)。荧光法线性扫描；激发波长306nm，发射波长500nm(系经荧光分光光度计测得后拟定)，狭缝0.05 mm×5 mm，ΔY=0.2 mm。

标准曲线的绘制：取橙皮苷对照品适量，以甲醇作溶剂制成0.5 mg/ mL的标准溶液。用微量注射器分别吸取1、2、3、4、5μL,小心点于一张聚酰胺薄膜上，以甲醇展开,取出，晾干，喷以1%三氯化铝的甲醇溶液显色后，在紫外灯下定位，然后按上述仪器条件进行扫描测定。以测得此峰面积对橙皮苷的量(μg)，绘制标准曲线。回归方程为［3］：C＝0.0016Ａ-1.3171，ｒ＝0.9991。

样液制备：按步骤4中方法制备。

样品测定［6］：精确吸取5μL和对照品溶液1μL，3μL,5μL小心点于一张聚酰胺薄膜上，以甲醇展开，展开后取出晾干，喷1%三氯化铝的甲醇溶液，于紫外灯下定位，放置3h(3-8h内斑点稳定)，然后扫描，由标准曲线中读取橙皮苷的量，或根据回归方程进行计算。

本法加样回收率为99.9%±2.13%。

仪器及测定条件：岛津LC-4A高效液相色谱仪，DEVELOSIL ODS-7柱(4.6 mm×300 mm)。流动相：乙腈-水-磷酸(180∶820∶0.1)；流速1 mL/min，检测波长254nm，柱温：40℃。

标准曲线绘制：精密称取橙皮苷样品0.0443 mg，甲醇溶解，定容至100 mL，吸取上述标准液2，4，6，8，10μL进样，进行HPLC测定，以进样量与峰面积作回归处理得方程[2]：

Y＝3.02×106Ｘ＋3.702×104,ｒ＝0.9991

样液制备：按步骤4中制备,但溶液最后须经0.45μm微孔滤器过滤，即得供试样液，

样品测定：取10μL样液进行HPLC测定，将测得的A峰(21 min)面积代入回归方程，得出供试样液中橙皮苷含量，并计算样品中橙皮苷含量。

本法加样回收率为100.69%，RSD为0.84%。

注释

1．本实验中提供了数个提取方法，可根据不同原料选用合适的提取方法。

2．生、熟石灰混合粉中含有一定数量不溶性CaCO3，其颗粒表面吸附有Ca2+而带正电荷，可以吸附蛋白质和果胶质而凝聚，以免生成胶体，有利于过滤。pH11-12是碱性体系中蛋白质、果胶质和其它胶质的凝聚点，并且在此时橙皮苷能较好地变成查耳酮型结构而溶于提取液，有利于橙皮苷提取，

3．实际在测定时需要根据当时仪器和其它条件实时测定并重新制作标准曲线。此处回归方程仅供参考，不能套用。

4．在定量分析试验中，样液制备过程中采用的提取方法要比一般提取过程效率要高，溶出速度要快一些，有利于节约测定时间。

5．若样品含柚皮苷，TLC可将其与橙皮苷分开，对分析结果无干扰；另外标准品在1-4μL范围内积分值与样品量呈线性关系，故定样量应控制在直线性范围以内。

6．若样品有黄芩苷，它与橙皮苷结构近似，在紫外光区的吸收波长相近，吸收峰重叠，在上述分离条件下，黄芩苷留在原点，橙皮苷Ｒｆ值约为0.7,两者可完全分离，不影响测定。

思考题

1．   一般的分光光度法测定黄酮和本实验中所用的薄层扫描法定量测定有何异同点？

试比较本实验中所采用的4种提取橙皮苷方法的优缺点。