【干货】手把手教你快速做出高质量的标准曲线 |
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荧光定量实验中,绝对定量主要利用标准曲线和样品的Ct均值来推算样品的真实拷贝数,而相对定量主要利用目的基因和内参基因的相对标准曲线,来帮助判断样品的模板稀释倍数和引物的扩增效率。小编今天就带大家制作出高质量的标准曲线。 绝对定量分析中标准曲线制作方法 标准品的制备 标准品可以是包含目的片段的PCR产物,可以是包含目的片段的质粒,或体外转录的RNA。标准品提供一个浓度标准,如果产生降解,也就不能被用做标准了。质粒是最稳定也是最常用的标准品。 01 质粒标准品制作流程 Step1. 以DNA/cDNA为模板,利用定量引物扩增目的片段。 Step2. 目的片段连接到线性化质粒载体上。 Step3. 阳性斑筛选,测序鉴定后,完成质粒标准品构建。 Step4. 利用紫外分光光度计测定质粒浓度,根据质粒大小即可换算出其浓度或者拷贝数。 Step5. 原浓度标准品以10为倍数按照下图方式进行倍比稀释,得到6个不同浓度的标准品。 02 标准品模板拷贝数计算方法 以双链DNA为例: 1 OD260 = 50 ng/μl 双链DNA 待测样本浓度(ng/μl) = OD260×50 (×稀释倍数) 脱氧核苷酸平均分子量=324.5 1 μl双链DNA标准品物质的量(mol) = (稀释倍数×OD数×50×10-9)/(序列长度×649) 1 μl双链DNA标准品的数量(copies) = (稀释倍数×OD数×3×1016)/(序列长度×649) 标准曲线的制作 以不同浓度的标准品为模板,每一个标准品至少3个技术重复,同时做qPCR扩增,如果在荧光定量仪器上提前设置好标准品的不同浓度,那么反应结束后,仪器会自动生成标准曲线,当然我们也可以用EXCEL软件来生成标准曲线。 上图是我们得到的一个标准曲线的案例,横坐标是模板浓度的lg值,纵坐标是Ct值,公式y=-3.2825x+31.906代表两个变量之间的线性关系,也就是所测反应体系及引物的标准曲线。我们主要通过以下三个要素来评判标准曲线的质量高低。 1. R2:称为决定系数,要求大于0.98,值越高,代表标准曲线的线性化程度越好。 2. 扩增效率En: 要求扩增效率在90%-110%范围内,后续定量结果才更准确,扩增效率En=10-1/斜率 - 1,由公式推算出满足条件的斜率范围是-3.58至-3.1之间。 3. 线性范围:指的是Ct值和模板浓度的lg值之间呈线性关系时模板浓度范围,过低的模板浓度(试剂灵敏度不高)或者过高的模板浓度(含有抑制剂影响)可能不呈线性关系,如果样本浓度超过线性范围,定量不准确。因此,线性范围越宽广,能够准确测量样本浓度的范围也越宽广。 标准曲线常见问题及解决办法 01 相对定量实验中的标准曲线如何制作? 在相对定量实验中无需采用已知浓度标准品制作标准曲线,但需要利用cDNA进行倍比稀释(2-5倍),同时对目的基因和内参基因进行定量扩增,从而分别制作它们的相对标准曲线。 02 R2 |
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