来源：雪球App，作者： 江苏耀海生物CDMO，（https://xueqiu.com/9950954021/237382887）

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前言

接上两回菌菌给大家介绍了PCR技术扩增相关知识点，这次菌菌依约带来了PCR的衍生产品——实时定量PCR（real time quantitative PCR,qPCR）。回顾一下，PCR技术作为经典的分子生物学研究手段，如今仍在被广泛使用。样品中即使只有一个拷贝的靶基因模板也可以在PCR中实现扩增，从而通过凝胶电泳、毛细管电泳等终点法手段检测出来。PCR技术使模板DNA以指数扩增方式产生更多拷贝数量的子代DNA，起始模板量与任何特定循环中积累的PCR产物数量之间存在定量关系。

菌菌带大家回顾的内容详情可见【星耀小课堂】PCR扩增技术之引物设计要点。耀海生物在获取目的基因片段时通常采用PCR扩增技术，通常以质粒为模板，以同源重组引物进行PCR扩增，设置成熟的扩增体系与条件，扩增产物再经琼脂糖凝胶电泳分离检测。

由于模板DNA中容易残留抑制PCR反应的物质，如血红素、肝素钠、免疫球蛋白IgG等，以及随着反应的进行，底物的消耗和焦磷酸盐分子的积累，聚合酶扩增效率开始降低，模板DNA不再以指数扩增的形式生成子代DNA，最终到达平台期，随着循环数的增加也不再生成PCR产物。因此，用PCR产物的终点法不能实现对初始模板的定量分析，同一模板起始量的多次重复PCR实验也可能产生不同数量的产物。只有处在PCR反应的指数扩增阶段,才能通过PCR产物的数量对未知样本初始模板量进行定量。

由于PCR技术具有极高的敏感性,扩增产物总量的变异系数常常达到10%-30%。因此，人们普遍认为应用简单方法对PCR扩增的产物进行最终定量是不可靠的。随着技术的进步,20世纪90年代末期出现了实时定量PCR（real time quantitative PCR,qPCR）技术，利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的累积速率绘制动态变化图, 从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数的问题。

qPCR技术是在传统PCR技术的基础上引入荧光化学物质，以达到实时监测PCR反应过程的目标，同时通过扩增产物量的变化情况可对初始模板量进行定量分析。与PCR技术相比，qPCR技术最大的优势体现在“定量”和“实时荧光监测”两个方面。因此，qPCR技术原理包括定量分析的数学原理和产生荧光的化学原理。

qPCR技术数学原理：

qPCR技术的本质是PCR技术，在扩增的每个循环中模板DNA通过变性、复性、延伸三个阶段形成更多数量的子代DNA，为下一个循环提供模板DNA。在每个循环结束后，仪器会激发荧光物质并检测一次荧光信号，那么每一个循环都会对应一个荧光信号值，将所有荧光信号值用光滑的曲线进行连接起来，便是 qPCR扩增曲线。如图1所示，根据qPCR扩增曲线整体趋势，整个扩增过程主要分为四个时期，分别是基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。

在基线期和平台期，荧光信号均维持水平状态，均不适用于对初始模板进行定量分析。在线性增长期，虽然扩增反应仍在进行，但随着反应产物的积累，PCR反应受到明显抑制导致扩增效率不断降低，此时产物不再以指数形式增长，同样不适用于定量分析初始模板量。而在指数增长期，由于底物充足，聚合酶活性高，反应产物以指数形式积累，且与初始模板量存在定量关系，因此，在该时期对模板起始量进行定量分析最准确且重复性最好。

Ct值，是在指数增长期内，荧光信号到达荧光检测阈值时所经历的循环数，其中C代表循环(Cycle)，t代表阈值（threshold)。每条扩增曲线的Ct值都与初始模板量的对数存在线性关系，初始模板的拷贝数浓度越高，对应的Ct值越小;反之则越大。因此，先根据已知拷贝数浓度标准品的扩增曲线拟合出标准曲线方程，再将样本扩增曲线的Ct值代入标准曲线方程中，便可计算未知样本初始模板的拷贝数浓度，从而实现定量分析。

                                                       图1 qPCR扩增曲线

qPCR技术化学原理

SYBR Green I染料法

实时定量PCR反应在带透明盖的塑料小管中进行，激发光可以直接透过管盖，激发荧光探针。荧光探针事先混合在PCR反应液中,只有与DNA结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成目的DNA片段的增加,结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光也相应增加。最简单的DNA结合的荧光探针是非序列特异性的，以非饱和染料中最常用的SYBR GreenI染料为例，这种荧光染料激发光波长520 nm,只能与双链DNA结合，与DNA双链结合时,荧光强度出现明显增大的非特异性染料。每形成一条DNA双链，就有相应数量的SYBR Green I染料嵌入并产生荧光，因此荧光信号强度变化与PCR产物浓度变化呈正相关，原理如图2所示。

耀海在进行质粒拷贝数测定时采用qPCR染料法，即大肠杆菌克隆表达得到的质粒DNA，其菌种质粒拷贝数的测定采用荧光定量PCR法。以质粒中卡那霉素抗性基因序列为靶标基因设计扩增引物，建立基于SYBR的qPCR检测方法，用于某大肠杆菌菌种中质粒拷贝数的检测。

图2 SYBR Green I作探针的实时定量PCR实验过程图示（加入到PCR反应体系中的荧光染料SYBR Green I仅能与双链DNA结合，被激发出绿色荧光，其荧光强度反映PCR产物的产量）

TaqMan探针法

利用SYBR Green I可以检测PCR反应中获得的全部双链DNA,但是不能区分不同的双链DNA。为了进一步确保荧光检测的就是靶DNA序列，人们又设计了仅能与目的DNA序列特异结合的荧光探针，如TaqMan探针。TaqMan探针是一小段被设计成可以与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA（一般为50-150 bp）,并且该单链DNA的5'和3'端带有短波长和长波长两个不同荧光基团。这两个荧光基团由于距离过近，在荧光共振能量转移（FRET）作用下发生荧光淬灭，因而检测不到荧光。PCR反应开始后，随着双链DNA变性产生单链DNA，TaqMan探针结合到与之配对的靶DNA序列上，并被具有外切酶活性的Taq DNA聚合酶逐个切除而降解，从而解除荧光淬灭的束缚，荧光基团在激发光下发岀荧光，所产生的荧光强度直接反映了被扩增的靶DNA总量。

                                图3 应用TaqMan探针的实时定量PCR技术

图3示解析：TaqMan探针具有3个要素：一端的短波长荧光基因（菱形），一段目的DNA特异的碱基序列和另一端的长波长荧光基因（小圆形），探针上的荧光基因十分接近，因此两个荧光基因相互发生淬灭，不产生绿色荧光。探针上的特异的碱基序列被设计成能与目的DNA中部序列结合，在PCR反应中，当Taq聚合酶延伸链时，它的核酸酶活性会逐个切掉结合在目的DNA中部的TaqMan探针的碱基，从而使两个荧光基因被释放出来，解除了荧光基团的束缚。短波长的荧光基团在激发光下产生绿色荧光，它的荧光强度反映新合成目的DNA的产量。

通过实时定量PCR确定靶基因表达强度时，每次实验都应设阴性对照和4个以上的标准品（将已知浓度的DNA模板进行一系列的稀释后成为标准品），每个样品都至少平行做3个重复。通常以10-15个循环的荧光值作为阈值或基线，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。图4a显示随着扩增反应循环数增加,代表扩增产物含量的荧光强度增加;图4b中标准曲线由标准样品浓度的lg值和其相对应的Ct值所组成。Ct值是产物荧光强度首次超过设定阈值时,PCR反应所需的循环数。利用标准曲线，可以确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。

                             图4 用qPCR法分析未知样品靶基因的绝对表达量

总结

qPCR技术的诞生解决了传统PCR不能定量分析模板的问题，同时在闭管条件下就能读取荧光扩增曲线，避免开盖引起的产物气溶胶污染环境的问题，不仅弥补传统PCR技术的不足，还丰富PCR技术的应用场景。“实时”“荧光”“定量”是 qPCR技术的三个主要特点，而染料或探针则是实现“荧光”这一特点的主要的两种方式。好了，今天的话题就到此结束啦，下次菌菌将为大家带来PCR特异性扩增问题分析，敬请期待~