已有 55086 次阅读 2012-4-6 21:39 |个人分类:科研经验|系统分类:科研笔记| 经验, 操作, DEAEDEAE-Sepharose, 层析柱

 (1) 凝胶柱的装填

将层析柱（Φ2.6×20cm）于地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将溶胀后的DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶调成较稀薄的浆液盛于柱顶的容器中，然后在轻微搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速。平衡凝胶床约两倍柱体积左右，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质（如蓝色葡聚糖）来观察色带的移动，如果色带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。注意：层析柱一定要配套的，不可混用，如果出现漏液及气泡，只能重新装柱，会很浪费时间的。我就是因为柱子不配套，柱子一个一个拆开，排查原因，换配件，耽误了很长时间。柱子装好后，平衡时一定要时刻观察，防止出现气泡及漏液，一旦出现状况立即解决，若在进样时出现问题，将会让你很崩溃的~

(2) 上样

取粗多糖样品0.1g，用超纯水溶解，配成浓度为10mg/ml的溶液，过0.45μm滤膜后上DEAE-Sepharose Fast Flow柱（Φ2.6×20cm），流速为1mL/min，用部分收集器收集洗脱液，每5ml收集一管，洗脱至洗脱液没有多糖检出为止。注意：开始时，我使用此条件进行摸索的，先用蒸馏水进行洗脱，直至没有糖检出为止，然后设置不同的氯化钠浓度梯度，进行洗脱。条件摸索完之后，然后可以进行多次大量的纯化，收集所需要的组分峰。

a、用苯酚-硫酸法测定其中的多糖含量。以管数为横坐标，以吸光度为纵坐标，得到多糖的洗脱曲线，并分别收集不同洗脱峰各管洗脱液。

b、在280nm的紫外分光光度计测每管的吸光度值，以管数为横坐标，以吸光度为纵坐标，得到蛋白质的洗脱曲线。

在用阴离子交换层析柱纯化多糖过程中，以不同离子强度的盐溶液洗脱，分部收集洗脱液，合并多糖单一峰部分，透析,浓缩。     （3）凝胶的再生         可以用氢氧化钠进行再生，然后用蒸馏水洗至中性即可，经过实验验证，对分离效果没有影响。

 (4) 凝胶柱的保存

一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在层析后加入0.02%的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。另外可以用20%的乙醇进行保存，4℃冰箱储存即可。         祝大家实验进展顺利！并欢迎大家就此进行交流学习！