②黄酮类化合物分子中羟基苷化后，极性即随之增大，故在醇性展开剂中Rf值相应降低，同一类型苷元，Rf值依次为：苷元＞单糖苷＞双糖苷。

③以在BAW中展开为例，多数类型苷元（花色苷元例外）Rf值在0.70以上，而苷则小于0.70。但在用水或2%～8%HOAc，13%NaCl水溶液或1%HCl展开时，则上列顺序将会颠倒，苷元几乎停留在原点不动，苷类的Rf值可在0.5以上，糖链越长，则Rf值越大。

（二）吸附色谱

硅胶薄层色谱：用于分离与鉴定弱极性的黄酮类化合物较好。

展开剂：甲苯-甲酸甲酯-甲酸（5：4：1），并可以根据待分离成分极性的大小适当地调整甲苯与甲酸的比例。另外尚有苯-甲醇（95：5）、苯-甲醇-乙酸（35：5：5）、三氯甲烷-甲醇（8.5：1.5，7：0.5）、甲苯-三氯甲烷-丙酮（40：25：35）、丁醇-吡啶-甲酸（40：10：2）等。分离黄酮苷元的衍生物如甲醚或乙酸乙酯等中性成分，可用苯-丙酮（9：1）、苯-乙酸乙酯（7.5：2.5）等为展开剂。

聚酰胺薄层色谱：适用范围较广，特别适合于分离含游离酚羟基的黄酮及其苷类。

展开剂：由于聚酰胺对黄酮类化合物吸附能力较强，因而需要用可以破坏其氢键缔合的溶剂作为展开剂。在大多数展开剂中含有醇、酸或水。常用的展开剂有乙醇-水（3：2）、水-乙醇-乙酰丙酮（4：2：1）、水-乙醇-甲酸-乙酰丙酮（5：1.5：1：0.5）、水饱和的正丁醇-乙酸（1 00：1，1 00：2）、丙酮-水（1：1）、丙酮-95%乙醇-水（2：1：2）、95%乙醇-乙酸（1 00：2）、苯-甲醇-丁酮（60：20：20）等。

紫外及可见光谱在黄酮类化合物鉴别中的应用

一般程序如下：

（1）测定样品在甲醇溶液中的UV光谱。

（2）测定样品在甲醇溶液中加入各种诊断试剂后得到的UV及可见光谱。常用的诊断试剂有甲醇钠（NaOMe）、乙酸钠（NaOAc）、乙酸钠-硼酸（NaOAc-H3B03）、三氯化铝（AlCl3）及三氯化铝-盐酸（AlC13-HCl）等。

（3）如样品为苷类，则可先进行水解，或甲基化后再水解，并测定苷元或其衍生物的UV光谱。

（一）黄酮类化合物在甲醇溶液中的UV光谱特征

带Ⅰ在300～400nm区间，由B环桂皮酰系统电子跃迁引起；

带Ⅱ在220～280nm区间，由A环苯甲酰系统电子跃迁引起。

1.黄酮及黄酮醇类

两者UV光谱谱形相似，但带Ⅰ位置不同，可据此进行分类。

在黄酮及黄酮醇母核上，如7-及4′-位引入羟基、甲氧基等供电基，将促进结构重排，有利于实现上述电子转移，可引起相应吸收带红移。通常，整个母核上氧取代程度越高，则带Ⅰ将越向长波方向位移。

A-环氧取代程度可影响带Ⅱ峰的位置，取代程度越高，则带Ⅱ将越向长波方向位移。

B-环的取代基对其峰位影响甚微，但可影响它的形状。例如当B-环上仅有4′-氧取代时，带Ⅱ为单峰；而当B-环上同时存在3′，4′-二氧取代时，则带Ⅱ将为双峰（或一个主峰，并伴有一个肩峰）。

黄酮及黄酮醇母核上的羟基甲基化或苷化时，将引起相应吸收带，尤其带Ⅰ向紫位移。

当羟基乙酰化后，原来的酚羟基对光谱的影响将会完全消除。例如：具有4′-羟基的黄酮类在乙酰化后，将表现出与4′-甲氧基黄酮十分相近的光谱，据此可以鉴定黄酮类化合物母核上烷氧基的取代位置。

2.查耳酮及橙酮类

共同特征是带Ⅰ很强，为主峰；而带Ⅱ则较弱，为次强峰。

查耳酮中，带Ⅱ位于220～270 nm，带Ⅰ位于340～390 nm，有时分裂为Ⅰa（340～390 nm）及Ⅰb（300～320 nm）。

与黄酮、黄酮醇类化合物一样，环上引入氧取代基，也会引起吸收带、尤其带Ⅰ向红位移（如下表），在2′位上引入-OH时影响最大。2′-OH甲基化或苷化时，可引起带Ⅰ向紫位移15～20nm，但其余位置的结构变化对带Ⅰ影响不大。

橙酮中，常显现3～4个吸收峰，但主要吸收峰（带Ⅰ）一般位于370-430nm，天然来源的橙酮可为388～413nm。羟基甲基化或苷化时对光谱并不产生显著影响，但6，7-二羟基橙酮中的7-羟基除外。后者如被甲基化或苷化，可使带Ⅰ向紫位移18nm。

3.异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇

这三类化合物中，除有由A-环苯甲酰系统引起的带Ⅱ吸收（主峰）外，因B-环不与吡喃酮环上的羰基共轭（或共轭很弱），故带Ⅰ很弱，常在主峰的长波方向处有一肩峰。

根据主峰的位置，可以区别异黄酮与二氢黄酮及二氢黄酮醇类。前者在245～270 nm，后两者在270～295 nm 。

黄酮类化合物UV吸收范围

（二）加入诊断试剂后引起的位移及其在结构测定中的意义

1.加入诊断试剂后黄酮及黄酮醇类化合物的紫外光谱

（1）乙酸钠/硼酸

黄酮类化合物分子中如果有邻二酚羟基结构单元时，可在乙酸钠碱性下，与硼酸螯合，并引起相应峰带红移。

带Ⅰ 红移12～30nm，B环有邻二酚羟基

带Ⅱ 红移5～10nm，A环有邻二酚羟基

（不包括5,6位邻二酚羟基）

（2）三氯化铝及三氯化铝／盐酸

分子中有邻二酚羟基或3-羟基－4-酮基，或5-羟基－4-酮基时，还可以与三氯化铝络合，并引起相应吸收带红移。

生成的铝络合物相对稳定性按下列顺序排列：黄酮醇的3-OH＞黄酮的5-OH＞二氢黄酮的5-OH＞邻二酚羟基＞二氢黄酮醇的3－OH。

邻二酚羟基及二氢黄酮醇3-OH系统与三氯化铝形成的络合物很不稳定，加入少量酸水（如盐酸）时即可分解（见下式）。二氢黄酮醇的铝络合物可因在乙酸钠中不稳定而予以鉴别。

AlCl3/HCl ＝ MeOH谱图——无3-及/或5-OH

AlCl3/HCl ≠ MeOH谱图——可能有3-及/或5-OH

带Ⅰ 红移35～55nm，有5-OH而无3-OH

红移50～60nm，有3-或3-和5-OH

AlCl3/HCl ＝ AlCl3谱图—— 结构中无邻二酚羟基

AlCl3/HCl ≠ AlCl3谱图—— 可能有邻二酚羟基

带Ⅰ 紫移30～40nm，B环有邻二酚羟基

紫移50～65nm，A、B环具有邻二酚羟基

（3）甲醇钠（碱性较强，可使黄酮类化合物母核上的所有酚羟基解离，导致相应的吸收带红移）

带Ⅰ 红移40 ～ 65nm，强度不变或增加 有4’-OH

红移50 ～60nm，强度减弱 有3-OH，但无4’-OH

2.加入诊断试剂后的异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇的紫外光谱

因该组化合物的桂皮酰共轭系统被破坏，所以紫外光谱主要显现来自苯甲酰共轭系统的峰带Ⅱ，对峰带Ⅱ的吸收影响最大的是7位羟基和5位羟基。

（1）利用乙酸钠检测异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇的7位羟基：

（乙酸钠显弱碱性，可使黄酮类化合物母核上酸性较强的酚羟基解离，从而导致相应的吸收带红移）

7-OH异黄酮 红移6～20nm（6位有氧取代时，观测不到）

5,7-OH二氢黄酮及二氢黄酮醇 红移34～37 nm

7-OH二氢黄酮及二氢黄酮醇 红移51～58 nm

在乙酸钠中7-羟基异黄酮的紫外光谱带Ⅱ的移动

（2）利用三氯化铝/盐酸检测异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇的5位羟基：

带Ⅱ 5-羟基的异黄酮 红移10～14 nm

5-羟基二氢黄酮、5-羟基二氢黄酮醇 红移20～28nm

3.加入诊断试剂后的查耳酮、橙酮的紫外光谱

（1）利用甲醇钠检测查耳酮的4-羟基或2-及4′-羟基： 带Ⅰ 红移60～100 nm，强度增强有游离4-羟基的查耳酮 红移60～100 nm，强度不变没有4-羟基，但有一个2-或4′-羟基

（2）利用甲醇钠检测橙酮的4′-羟基及6-羟基： 带Ⅰ 红移70～95 nm 有游离4′-羟基或6-羟基红移幅度减小同时有4′-和6-羟基

（3）利用三氯化铝和三氯化铝/盐酸对紫外光谱的影响，检测查耳酮和橙酮的邻二酚羟基： 查耳酮和橙酮中B环上的邻二二酚羟基均可利用加入三氯化铝后，其紫外光谱的带Ⅰ向长波移动40～70 nm（以样品加入三氯化铝/盐酸诊断试剂后的紫外光谱中带Ⅰ的位置为基准）来检出。

（4）利用三氯化铝/盐酸对紫外光谱的影响，检测查耳酮的2′-羟基：2′-羟基查耳酮的紫外光谱的带Ⅰ在含有三氯化铝/盐酸的溶液中大幅度向长波移动（40～60 nm）。

氢核磁共振在黄酮类化合物结构分析中的应用

溶剂：

氘代三氯甲烷

氘代二甲基亚砜（DMS0-d6）

氘代吡啶

无水DMS0-d6（没有作成衍生物的黄酮类化合物）

也可将黄酮类化合物作成三甲基硅醚衍生物，溶于四氯化碳中进行测定。

（一）A环质子

1. 5，7-二羟基黄酮类化合物

H-6总比H-8在较高场（H-6位移数字小）

当7-OH成苷时，则H-6及H-8信号均向低磁场方向位移

2. 7-羟基黄酮类化合物

H-5 δ8.0 d, J＝9.0 Hz

（C-4位羰基强烈的负屏蔽作用，处于低场位置）

H-6 δ6.70～7.10 dd, JH-5=9.0Hz, J

H-8=2.5HzH-8 δ6.70～7.00 d, J=2.5Hz）

与5，7-二羟基黄酮类化合物比较，在7-羟基黄酮类化合物中H-6及H-8均将出现在较低的磁场内，化学位移值大小的顺序可能颠倒

（二）B环质子

1.4′-氧取代黄酮类化合物

H-2′、H-6′ AA ′BB ′系统，

H-3′、H-5 δ 6.50～7.90， J＝8.5 Hz

大体上位于比A环质子稍低的磁场区

H-3′、H-5′的化学位移总是比H-2′、H-6′的化学位移值小， 由于4′-OR取代基的屏蔽作用，以及C环对H-2′、H-6′的负屏蔽效应

H-2′、H-6′的具体峰位取决于C环的氧化水平，氧化水平越高，位移值越大。

2. 3′，4′-二氧取代黄酮及黄酮醇

H-2′ δ7.20～7.90 d，J＝2.5 Hz

H-5′ δ6.70～7.10 d，J＝8.5 Hz

H-6′ δ7.20～7.90 dd，J H-5′ ＝8.5，J H-2′ =2.5 Hz

依据H-2′及H-6′的化学位移，可以区别黄酮及黄酮醇的3′，4′-位上是3′0H，4′-OMe还是3′-0Me，4′-0H。

3.3′，4′-二氧取代异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇　

H-2′、H-5′及H-6′将作为一个复杂的多重峰（常常组成两组峰）出现在δ6.70～7.10区域内。此时C环对其影响很小，各质子的化学位移将主要取决于它们相对于含氧取代基的位置。

4.3′，4′，5′-三氧取代黄酮类化合物　

当B环有3′，4′，5′-三羟基时，H-2′及H-6′将作为相当于两个质子的一个单峰，出现在δ6.50～7.50范围内。但如3′-或5′-OH甲基化或苷化时，则H-2′及H-6′将分别以不同的化学位移作为一个二重峰（J＝2.0 Hz）出现。

（三）C环质子

1.黄酮类

该类化合物的H-3常常作为一个尖锐的单峰信号出现在δ6.30左右。因此，在5，6，7-或5，7，8-三含氧取代黄酮中，它将与A环的孤立芳氢（H-8或H-6）的单峰信号相混，应当注意区别。黄酮醇类的3位H被-OH取代，故1H-NMR上无C环质子。

2.异黄酮类

异黄酮上的H-2，因正好位于羰基的β位，且通过碳与氧相接，故将作为一个单峰出现在比一般芳香质子较低的磁场区（δ7.60～7.80），当用DMS0-d6作溶剂时，还将进一步移到δ8.50～8.70处。

3.二氢黄酮及二氢黄酮醇

（1）二氢黄酮：

H-2与两个磁不等同的H-3偶合（Jtrans＝11.0 Hz；Jcis＝5.0 Hz），故作为一个双二重峰出现，中心位于δ5.20处。

两个H-3，因有相互偕偶（J＝17.0 Hz）及H-2的邻偶，将分别作为一个双二重峰出现，中心位于δ2.80处，但两组峰常有相互重叠现象。

（2）二氢黄酮醇：

在天然存在的二氢黄酮醇中，H-2及H-3多为反式双直立键，故分别作为一个二重峰出现（J＝11.0 Hz）。H-2位于δ4.90前后，H-3则位于δ4.30左右，两者很容易区分，据此还可确定C-2.及C-3的相对构型，即两质子互为反式，可用下式表示。

当3-OH成苷时，则使H-2及H-3信号均向低磁场方向位移，如表6-16。据此可以帮助判断二氢黄酮醇苷中糖的结合位置。

（四）糖上的质子

1.单糖苷类

2.双糖苷类

（五）C6-CH3及C8-CH3质子

（六）乙酰氧基的质子

（七）甲氧基上的质子

碳核磁共振在黄酮类化合物结构研究中的应用

黄酮类化合物13C-NMR信号的归属一般可以通过：

①与简单的模型化合物如苯乙酮、桂皮酸以及它们的衍生物的图谱进行比较； ②用经验性的简单芳香化合物的取代基位移加和规律进行计算等方法加以解析。③在13C-NMR谱上，可以通过黄酮C环中央三个碳核信号的位置以及它们在偏共振去偶谱中的裂分情况，推断黄酮类化合物的骨架类型。

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