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作者：

王锦楠

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摘要：

生长调节因子(Growth-regulating factor,GRF)是一类植物特有的转录因子,在植物的生长发育过程中发挥重要调控作用.目前,拟南芥,水稻和玉米等草本植物的GRF基因功能研究较为活跃,研究人员发现GRF在叶片大小控制,根发育,茎径向生长等生长发育中发挥着重要调控作用.GRF的调控作用较为复杂,其不但受mi R396的调控,而且与GIF(GRF-interacting factor)发生互作,以模块方式调控下游基因的表达.在具有次生生长的木本植物中,GRF的功能研究刚刚开始,作者所在的实验室前期研究发现杨树GRF同样参与了叶片大小及次生生长的调控,但作用机制有待深入研究.鉴于GRF基因在木本植物生长发育调控中的重要作用,本研究以银腺杨(Populus alba×P.glandulosa)克隆84K的GRF基因对PagGRF12a和PagGRF12b为研究对象,通过表达模式分析,遗传转化分析,互作分析,下游靶基因分析及结构域互换分析等,探究GRF12a和GRF12b在杨树生长发育的调控作用及其机制.本研究获得主要结果如下:1,依据生物信息学分析,降解组分析以及瞬时转录激活实验结果,发现毛果杨的Ptr GRF12a与Ptr GRF12b是来自基因组/基因加倍的一对基因(gene pair,基因对),然而Ptr GRF12a表达受mi R396调控,而Ptr GRF12b是唯一不受mi R396调控的杨树GRF基因.2,PagGRF12a和PagGRF12b过表达杨树叶片均较对照大,组织细胞学观察结果显示,叶片细胞数目增多,细胞大小变小.定量结果显示细胞增殖标志(marker)基因的表达在过表达植株中显著增加,而细胞扩展marker基因的表达在过表达植株中显著降低.以上结果表明,PagGRF12a和PagGRF12b同时调控细胞增殖和细胞扩展,且主要通过调控细胞增殖影响叶片发育,参与叶片大小的控制.3,PagGRF12a过表达杨树株高与胸径比对照有降低的趋势,而PagGRF12a反义抑制杨树则与之相反.对转基因杨树茎的横切观察结果显示,PagGRF12a过表达杨树木质部与胸径的比值较对照显著降低,而PagGRF12a反义抑制杨树则与之相反,表明PagGRF12a可以抑制木质部发育.随后,通过基因表达分析,Ch IP-PCR分析,转录调控分析,酵母双杂交及荧光素酶互补实验等,发现PagGRF12a可以与PagGIF1b相互作用形成复合体,直接激活木质部发育调控因子XYLEM NAC DOMAIN1(XND1a)的表达,抑制木质部发育.4,PagGRF12b过表达杨树株高与胸径比对照有增加的趋势.对转基因杨树茎的横切观察结果显示,PagGRF12b过表达杨树木质部与胸径的比值较对照显著增加,表明PagGRF12b可以促进木质部的发育.基因表达分析,Ch IP-PCR分析,转录调控分析,酵母双杂交及荧光素酶互补实验结果显示,PagGRF12b可以与PagGIF1a相互作用形成复合体,抑制XND1a的表达,促进木质部发育.5,创制了PagGRF12a和PagGRF12b的QLQ和WRC结构域互换的PagGRF12a Q12b W和PagGRF12b Q12a W过表达杨树.表型观察发现PagGRF12a Q12b W过表达杨树木质部宽度变窄,而PagGRF12b Q12a W过表达杨树木质部宽度变宽,表明QLQ结构域在PagGRF12a和PagGRF12b调控木质部发育中发挥着重要作用.本研究对PagGRF12a和PagGRF12b在杨树生长发育尤其是次生生长过程中的作用进行了详细的研究,揭示了PagGRF12a和PagGRF12b可以通过调控细胞增殖和细胞扩展影响叶片发育,通过调控XND1a的表达影响木质部发育.这些研究为揭示林木叶片发育以及木材形成相关调控机制提供重要基础,同时解析了GRF基因在杨树生长发育中的作用,为其作为靶基因进行木本植物的改良提供了依据.

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