| 文章来源于微信公众号“ELISPOT专栏”

ELISpot技术原理

酶联免疫斑点检测（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay, ELISpot），从字面上来说，可以分解成两部分：“酶联免疫”与“斑点”。此处的“酶联免疫”与ELISA中的含义相同，都是指基于酶促反应放大效应的免疫学检测。与ELISA一样，ELISpot的抗体也是吸附（包被）在固体基板上，所不同的是：ELISA抗体捕获的目标来自样本溶液中已经存在的、均匀分布的蛋白，而ELISpot抗体捕获的目标来自于样本细胞在动态刺激过程中新鲜分泌的蛋白；ELISA显色出来的是或深或浅的有色溶液，而ELISpot显色出来的是沉积在固体基板上或多或少的有色斑点，这也是ELISpot一词中“斑点”的来历。从技术本质上，ELISpot和ELISA都是基于双抗夹心法原理，但是ELISpot在ELISA的基础上又加入了细胞培养技术。

简单地说，ELISA是对检测样本溶液中靶蛋白的浓度进行定量测定，而ELISpot是对样本中活细胞免疫状态进行动态的检测评估。

酶联免疫斑点检测（ELISpot）是一种高度敏感的免疫检测技术，可在单细胞水平检测细胞因子/抗体等分泌细胞的频率。在存在或不存在刺激的情况下，将细胞培养在包被特异性捕获抗体的PVDF板中。由细胞分泌的蛋白质，例如细胞因子，被特异性包被抗体捕获。在适当的孵育时间后，去除细胞并加入生物素化的检测抗体和链霉亲和素-酶偶联物。最后通过显色系统形成沉淀物，即“斑点”。

ELISpot技术集高灵敏度，高通量，单细胞水平，功能检测等优点于一身，已广泛应用于疫苗的开发和临床评估，传染病和自身免疫性疾病的临床诊疗和疗效评估，细胞治疗的疗效评估，基因治疗的毒性评估，癌症疫苗和治疗的评估，和免疫学基础性研究等（详见ELISpot应用章节：）。

ELISpot技术流程图

1.包被

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2.细胞孵育

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3.细胞因子捕获

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4.检测抗体

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5.酶偶联链霉亲和素

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6.底物显色

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7.斑点计数和数据分析

ELISpot斑点

“一个阳性细胞，对应一个ELISpot斑点”，这是ELISpot检测的理论前提。无数的实验也证明了这一点。现有的抗体技术以及酶联放大技术确实可以把单个细胞分泌细胞因子的行为记录下来，ELISpot板上的每一个斑点就是最好的证明。下面我们来看一看ELISpot斑点的特征。

圆形，有核晕结构

这是判定真假ELISpot斑点的主要标准。ELISpot斑点的这种结构可以从物理学的原理得到很好的理解和解释。悬浮在ELISpot板孔中的细胞，它分泌细胞因子是没有方向性的，均匀地向四面八方扩散，如果扩散到ELISpot板膜上，就会被板膜上的包被抗体捕获。在所有从细胞到板膜的路径中，有条路径最短，即位于细胞正下方到板膜的垂直距离。路径越短，扩散中耗散损失就越少，到达该点的细胞因子就越多，显色的时候颜色就越深。以垂直距离点为圆心，向外画一系列的同心圆，同心圆的直径越大，细胞因子扩散的距离就越长，耗散越多，到达的细胞因子就越少，颜色也就越浅。当超过一定距离之后，扩散到达的细胞因子就减少到背景水平了，这就是斑点的边界。即所谓的“核晕”结构。

大小不均一，正态分布

ELISpot斑点要比产生它的那个细胞大很多。我们知道，PBMC细胞直径约是6-10μm，而ELISpot斑点的直径通常30-200μm。

细胞分泌蛋白（细胞因子或抗体）具有动态代谢学，受到相同的刺激，每个阳性细胞分泌蛋白的时间和能力都不一样，产生的斑点大小也不完全相同。这些斑点大小不一，但是如果把它们的直径统计出来，会发现它们呈正态分布。

不同的细胞、不同的刺激物、不同的分泌物斑点的直径（平均直径）也不同。通常来说，T细胞产生的斑点较大，单核巨噬细胞产生的斑点较小，B细胞产生的抗体斑点非常大；特异性的抗原（多肽或者蛋白）刺激产生的斑点大，非特异性的有丝分裂原（PHA、ConA等）刺激产生的斑点小；IFN-γ、IL-4等细胞因子的斑点大，IL-10、IL-12、Granzyme B之类的细胞因子的斑点小。

斑点质量的评估

好的斑点：呈圆形，清晰，致密，中间颜色深，边缘颜色浅，有典型的“核晕”结构。

差的斑点：呈圆形或椭圆形，不太规则，模糊，内部松散，也是中间颜色深，边缘颜色浅，也有“核晕”结构。

假斑点：形状不规则，颜色深浅不一，无“核晕”结构。加班点一般是某种原因形成的背景着色，如凋亡细胞，灰尘纤维等，并未由细胞分泌的细胞因子斑点。

非特异性斑点：比较小而黑的斑点，这些斑点并非真正的斑点，可能源自于小的细胞膜碎片/伪斑点，主要从大小，有无“核晕”结构，背景对照/阴性对照几个方面进行判断。避免或降低小斑点的措施：在所有孵育步骤之间和着色反应完成后彻底清洗板。