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2022年3月4日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心辛秀芳团队在Cell Press细胞出版社期刊Cell Host & Microbe发表了题为“Bacterial effectors manipulate plant abscisic acid signaling for creation of an aqueous apoplast”的研究论文，报道了调控ABA信号的TOPP-SnRK2模块被病原菌效应因子AvrE所干扰，导致ABA信号通路上调、气孔关闭，促进了胞间质水渍的产生和病原菌的侵染，从而揭示植物病原菌效应蛋白促进病害易感性的重要机制。

自然界中，病原菌的侵染严重威胁植物健康及作物产量。过去几十年对植物-病原菌互作的研究发现，很多革兰氏阴性细菌依赖III型分泌系统（Type III Secretion System, T3SS）将效应因子蛋白（Effector）分泌到宿主细胞或胞间质（细胞间隙），通过抑制宿主免疫或干扰宿主正常生理功能等方式来促进侵染。已经报道的效应因子，如丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）分泌的AvrE、HopM1及黄单胞杆菌（Xanthomonas gardneri）分泌的AvrHah1，能够诱导植物叶片产生水渍（water soaking），使得胞间质形成一种利于病原菌生长的、水分充足的环境，从而促进病原菌的侵染。实际上，人们在自然界很多植物病害发生的过程中都观察到了类似的水渍现象，猜测诱导水渍产生可能是一种被不同病原微生物广泛使用的侵染策略。之前丁香假单胞菌效应因子AvrE/hopM1在拟南芥中引起水渍产生的分子机制尚不清楚。

在这项研究中，作者发现AvrE与拟南芥I型蛋白磷酸酶（Type One Protein Phosphatase, TOPP）家族蛋白存在互作，通过CRISPR-cas9技术获得了TOPPs的多突变体。其中，五突突变体topp12537植物在高湿条件下（无病原物侵染时）在叶片上出现水渍的表型，且在病原菌侵染之后和野生型拟南芥Col-0相比也表现出更强的水渍，因此在丁香假单胞菌DC3000菌株侵染时更加感病。更有意思的是，敲除两个效应因子的avrE-/hopM1-菌株侵染时，TOPP1/2/3/5/7的突变能部分回补avrE-/hopM1-的侵染能力。此外,topp12537还表现出种子萌发和子叶展开延迟、气孔开度减小和脱落酸(Abscisic acid， ABA)信号上调的表型，这与之前报道TOPP负调控植物ABA信号的结果一致，说明AvrE可能靶向植物TOPP而干扰了植物ABA信号的调控。此外，SnRK2(Sucrose non-fermenting 1-Related protein Kinase 2s)作为ABA信号调控过程中的关键激酶，当ABA信号激活时，其活性位点S175的磷酸化（表征其激酶活性）显著增强。通过体外实验，作者证明了TOPP1/2/3/5/7能够抑制SnRK2.6的S175位点自磷酸化，但是AvrE能够解除这种抑制。通过烟草和拟南芥中的体内实验，作者验证了AvrE能够上调SnRK2.6的S175位点的磷酸化。最后，作者验证了DC3000侵染时能够上调植物叶片内的ABA含量，促进ABA相应基因的表达，诱导气孔关闭。同时，用病原菌侵染ABA合成缺陷突变体以及下游信号通路的突变体植物，减弱的水渍和更加抗病的表型进一步证明了ABA信号途径对于水渍产生的重要性。

综上，该研究发现，调控ABA信号的TOPP-SnRK2模块被病原菌效应因子AvrE干扰，从而导致ABA信号上调、气孔关闭，促进了胞间质水渍的产生，从而有利于病原菌的侵染。

作者专访

Cell Press细胞出版社特别邀请论文作者胡叶舟、丁彦霞、辛秀芳、赵杨进行了专访，请他们为大家进一步详细解读。

CellPress：

病原体感染是自然界中植物生存和作物生产力的最大威胁之一，其中一些效应因子会在植物叶片组织中形成富含水的质外体，或“water soaking”，请您为我们介绍一下，water soaking在不同植物致病系统中的影响。

辛秀芳团队：

在自然条件下，植物受到不同病原菌入侵的威胁，尤其是在高湿度环境下，许多病害的发生更为频繁。实际上，人们在自然界中很多植物地上部分被不同病原菌侵染的过程中都观察到过水渍（water soaking）的现象，如图片中所展示的，在病原菌侵染了西瓜、西红柿和棉花的叶片之后，会诱导植物叶片产生水渍。

图1 Acidovorax avenae subsp. citrulli

From the American Phytopathological Society (APS)

图2 F.E. Lanza et al., Journal of Plant Pathology (2013)

图3 Pkania C.K. (2016). Genetic diversity of cotton and bacterial blight (Xanthomonas citri pv. malvacearum) prevalence in Western Kenya. PhD Thesis, Ghent University, Belgium

在2016年发表在Nature上的这篇文章Bacteria establish an aqueous living space in plants crucial for virulence，使用拟南芥-丁香假单胞杆菌的模式生物发现了丁香假单胞杆菌中的两个效应因子AvrE和HopM1能够促进拟南芥叶片产生水渍表型，并且水渍的产生能够帮助丁香假单胞杆菌在外质体繁殖更多（有可能通过增加糖类等分子的溶解性、促进病原菌的营养吸收、或者稀释植物产生的抗菌物质等方式），从而促进丁香假单胞杆菌对植物的侵染。早在1994年，人们就观察到效应因子Avr6诱导的水渍，认为可能与黄单胞菌从侵染部位的释放过程相关。2017年发表在PNAS上的一篇文章（TALE-induced bHLH transcription factors that activate a pectate lyase contribute to water soaking in bacterial spot of tomato）中报道，在黄单胞菌侵染番茄、烟草和辣椒时观察到的水渍现象是由于AvrHah1效应因子靶向宿主的bHLH转录因子从而上调了果胶裂解酶的表达，导致胞间质渗透势增强、从环境中吸水导致的。此外，他们的研究认为，水渍的产生有利于更多的病原菌进入叶片胞间质和病原菌的扩散。因此除了提供营养丰富、利于病菌繁殖的微环境，水渍可能在促进病原菌移动等其他方面也有作用。此外，水渍的产生对植物免疫反应也可能造成影响，从多个方面影响了植物与病原菌之间的互作。

CellPress：

请问脱落酸(ABA)在植物适应非生物胁迫中发挥了怎样的作用？

辛秀芳、赵杨研究员：

在自然条件下，植物会受到多种非生物胁迫，例如高温、低温、干旱、盐胁迫等。其中ABA激素在植物应对干旱、盐胁迫和渗透胁迫等非生物胁迫过程中发挥了至关重要的作用。干旱诱导ABA的快速积累，促进气孔关闭，防止过多的水分散失；ABA信号促进胁迫响应基因的表达，诱导渗透调节物的积累，从而降低渗透势以维持水分获取。此外，ABA还对植物的生长发育进行调控，包括维持种子和芽的休眠，诱导叶片衰老，抑制地上部分的生长，促进根系生长，从而增强水分的获取和减少水分的消耗，应对干旱胁迫。

CellPress：

请问AvrE是如何通过拟南芥1型蛋白磷酸酶(TOPPs)来调控ABA的？

辛秀芳团队：

之前的研究表明，TOPP能够通过直接抑制ABA信号中关键激酶SnRK2的磷酸化而负调控ABA信号转导过程。我们分别通过体内、体外实验检测了AvrE对TOPP-SnRK2.6调控模块的影响，体外的实验表明，TOPP对SnRK2.6活性位点磷酸化的抑制在加入AvrE蛋白后被解除，即AvrE能够恢复SnRK2.6活性位点的磷酸化。而烟草瞬时表达系统中也观察到了AvrE对SnRK2.6活性位点磷酸化的增强。更重要的是，侵染过程中，丁香假单胞菌DC3000能够增强SnRK2.6的磷酸化，并且这一调节过程是依赖于AvrE效应因子的。此外，之前的研究表明，TOPP对ABA信号的负调控可能与其定位相关，细胞核定位的TOPP主要发挥负调控ABA信号通路的作用，在烟草中我们观察到AvrE的共表达能够显著减少核定位的TOPP蛋白。结合以上结果，我们认为，AvrE可能通过两种机制来影响TOPP对ABA信号的调节，1）直接通过蛋白互作或竞争性结合干扰TOPP对SnRK2的抑制；2）通过影响TOPP蛋白的细胞核定位（如TOPP入核或核质穿梭等过程），减少负调控ABA信号通路的核定位的TOPP，从而上调ABA信号通路。

CellPress：

请问植物ABA信号通路的激活和气孔的关闭在病原体诱导的water soaking发挥怎样的功能？

辛秀芳团队：

ABA信号通路激活和气孔关闭会造成植物在细胞和组织水平的生理状态发生很大改变，具体如何促进水渍产生还需要更多植物生理层面的探索。由于植物内的水分绝大多数都是通过气孔蒸发到空气中，不仅能够给植物“降温”，也能够通过蒸腾拉力在叶片中产生“负压”，为水分、离子等物质在根部和茎维管束中的运输提供动力。高湿度环境下，植物中的ABA含量会降低导致气孔打开，而丁香假单胞菌利用AvrE/HopM1两个效应因子诱导ABA上调和气孔关闭，可能导致在高湿度环境下，水分不能正常从气孔蒸发从而促进水渍的形成。此外，也不能排除AvrE调控的水渍过程可能还有其它蛋白（或AvrE的其它靶标）的参与，使得叶片中水分的正常运输过程发生紊乱而导致水渍。

CellPress：

本研究证明了植物疾病易感性的关键机制，请问您下一步的工作重点是什么？

辛秀芳团队：

这项工作再一次表明了ABA信号途径在植物应对生物胁迫过程中也扮演着重要的角色，并且证明了气孔关闭在效应因子AvrE/hopM1诱导形成的水渍过程中发挥重要作用。但我们另外一些实验证明，气孔关闭并不是水渍形成的充分条件，说明水渍形成过程还受其它因素或者生理过程的调控，有待探索发现。

作者介绍

从左到右依次是：胡叶舟（一作）、丁彦霞（一作）、辛秀芳（通讯作者）

辛秀芳，研究员、课题组长、博士生导师。2014年博士毕业于美国密歇根州立大学，2017年加入中国科学院分子植物科学卓越创新中心，同期加入中国科学院-英国约翰.英纳斯中心(John Innes Centre) 植物与微生物科学联合研究中心。长期从事“植物与微生物互作”研究，在 Nature、Cell Host & Microbe、Nature Review Microbiology等国际主流学术期刊发表多篇研究文章。获得2020年卫志明青年创新奖、2021年中国科学院优秀导师奖。现任Frontiers in Microbiology/Plant Science杂志编委会成员、中国植物生理与植物分子生物学学会植物微生物分子互作专业委员会副主任。

相关论文信息

▌论文标题：

Bacterial effectors manipulate plant abscisic acid signaling for creation of an aqueous apoplast

▌论文网址：

https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(22)00088-9

▌DOI：

https://doi.org/10.1016/j.chom.2022.02.002

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