植物病原真菌依据其生活方式可以分为活体营养型真菌、半活体营养型真菌及死体营养型真菌[1]。活体营养型真菌仅能生活在植物细胞中，不能在死体细胞中获取营养；而死体营养型真菌则主要从死体细胞中获取营养；半活体营养型真菌在获取营养物质方面则介于上述两种营养型真菌之间，既能在侵染初期作为寄生物在寄主上生活，又能在侵染后期作为腐生物从死体植物组织上获取营养[2]。植物与病原真菌互作过程中，病原真菌主要通过其分泌系统将分泌蛋白输入到植物组织中，这些蛋白通过与植物中具有防卫反应的相关蛋白发生多层次的免疫作用，进而形成类似于“军备竞赛”的植物与病原真菌的互作反应[3-5]。植物与病原真菌的互作理论研究主要涉及植物免疫理论、病原效应蛋白致病理论等[6]。作为真(卵)菌中效应蛋白的重要筛选来源，分泌蛋白在实现病原真菌侵染植物、定殖细胞以及对植物造成危害等方面发挥着重要作用[7-9]。

近些年，学术界对全基因组序列已经公布的植物病原菌(包括真菌、细菌以及卵菌等)中的分泌蛋白开展了诸多研究工作[7]，明确了包括稻瘟病菌[10]、香蕉枯萎病菌[11]、核盘菌[12]、灰霉菌[13]、致病疫霉[14]、大丽轮枝菌[15-16]、尖孢镰刀菌[17]、柑橘黄龙病菌[18]、甘薯长喙壳[19]、小麦叶锈菌[20]、黄单胞菌[21]以及细菌性黑斑病菌[22]等诸多植物病原菌中的分泌蛋白情况。上述研究对于进一步开展病原菌致病机制的解析及蛋白功能的研究提供了重要的理论支撑，然而，由于缺乏对比分析不同种类真菌或不同种类物种之间分泌蛋白的数量及功能情况，制约着学术界对于分泌蛋白在不同真菌中发挥作用的认知，影响着学术界对于不同营养方式植物病原真菌致病机制的解析工作。

因此，为了更好地明确不同种真菌之间分泌蛋白数量及功能情况，本研究选择模式生物、死体营养型真菌、半活体营养型真菌及活体营养型真菌等19种具有全基因组序列的真菌作为研究对象，根据真菌中分泌蛋白的典型特征，利用多种生物信息学分析工具，从信号肽、亚细胞定位、跨膜结构、锚定蛋白等方面进行层层筛选，明确上述真菌中的分泌蛋白数量及功能情况，同时，对不同营养方式真菌中分泌蛋白数量及功能展开对比研究，以期为深入开展不同营养方式真菌中分泌蛋白功能解析及致病机制研究工作奠定坚实的理论基础，并为后续开展生物学试验验证打下基础。

通过美国国立卫生院数据库(NCBI)下载19种具有不同营养方式真菌的全基因组序列，共获取了233362个蛋白序列，上述真菌所含有蛋白数量范围为6002-27347个，平均每个真菌含有12282个蛋白序列，真菌含有序列大小范围为12157105-140802721 Mb (表 1)。

根据分泌蛋白的基本特征，在Linux系统下利用SignalP v5.0[23]、ProtComp v9.0[24]、TMHMM v2.0[25]分别预测分析蛋白信号肽和预测分析亚细胞定位，同时利用Python脚本对数据进行筛选，排除具有跨膜结构的蛋白。再利用big-PI predictor预测分析GPI锚定蛋白等，排除具有GPI的锚定蛋白[26]。

利用Microsoft Excel 2010统计和分析分泌蛋白功能分布情况，并采用Origin 2019软件制图。

基于真菌中分泌蛋白所具有的典型特征(在N端含有信号肽、无跨膜结构域、无GPI锚定位点且不定位于胞内细胞器等)[7]，对19种不同营养方式真菌开展分泌蛋白预测分析，结果表明，通过SignalP v5.0预测，明确具有信号肽的蛋白数量为311-2495个，所占比例为5.18%-13.39%。其中，F. oxysporum具有信号肽的蛋白数量最多，为2021个，而S. cerevisiae所具有信号肽的蛋白数量最少，为311个；同时，就具有信号肽的蛋白数量占全部蛋白的比例而言，P. oryzae所具有信号肽的蛋白数量占比最高，为13.39%，而S. cerevisiae所具有信号肽的蛋白数量占比最低，为5.18% (图 1)。

进一步通过ProtComp v9.0预测软件对上述菌株中具有信号肽的蛋白进行亚细胞定位分析，结果显示，定位在细胞外的蛋白数量为72-731个，所占总蛋白数量比例为0.85%-5.09%，所占信号肽蛋白数量比例为14.45%-43.28% (图 2)。其中，M. larici-populina所具有的细胞外蛋白数量最多，为731个，S. cerevisiae所具有的细胞外蛋白数量最少，为72个；B. graminis所具有的细胞外蛋白数量所占比例最高，所占总蛋白和信号肽蛋白数量比例分别为5.09%和43.28%，S. sclerotiorum所具有的细胞外蛋白数量所占比例最高，所占总蛋白和信号肽蛋白数量比例分别为0.85%和14.45%，其余蛋白分别定位在细胞质膜、胞内细胞器和细胞质。进一步分析发现，4种活体营养型真菌具有信号肽的胞外蛋白数量所占总蛋白数量平均所占比例最高为3.67%，6种半活体营养型真菌为2.76%，6种死体营养型真菌为1.94%，3种模式生物为1.56%，除B. maydis的胞外蛋白数量所占总蛋白数量比例比U. maydis高0.08%外，其余5种死体营养型真菌及3种模式生物均比活体营养型真菌胞外蛋白数量所占比例低。同时，除P. oryzae和P. nodorum胞外蛋白数量所占信号肽蛋白数量比例为30.88%和28.26%外，4种活体营养型真菌胞外蛋白数量所占信号肽蛋白数量比例均比其余菌株高，平均为34.94%，而6种死体营养型真菌及3种模式生物平均所占比例最低，分别为21.35%和21.45%。

利用TMHMM v2.0以及Phobius等软件对上述所获得的蛋白进一步筛选，结果表明，上述所获得的蛋白中仅小部分蛋白具有2个及以上跨膜结构域，蛋白数量均为5个以下，其余大多数蛋白均不具有跨膜结构域(图 3-A)。接下来，利用big-PI predictor对上述不具有跨膜结构域的蛋白进一步筛选，结果表明，有1.93%-17.14%的蛋白具有GPI锚定蛋白，其中4种活体营养型真菌具有GPI锚定蛋白的平均所占比例最少，为3.64%，3种模式生物平均所占比例最高，为11.13% (图 3-B)，其余82.86%-98.07%的蛋白均无GPI锚定蛋白。通过上述分析，最终明确了不同营养方式真菌中具有典型特征的分泌蛋白数量，范围为58-712个，占总蛋白数量的0.74%-4.83%，其中尤以M. larici-populina所具有的分泌蛋白数量最多，为712个，所占总蛋白数量比例高达4.38%，而以B. graminis所具有的分泌蛋白数量所占总蛋白数量的比例最高，为4.83%，所具有的分泌蛋白数量为403个(图 3-C)。

为了进一步明确分泌蛋白数量与营养方式之间的关系，按照死体营养型真菌、半活体营养型真菌、活体营养型真菌进行分析，结果发现，4种活体营养型真菌所具有的分泌蛋白数量所占总蛋白数量的平均比例最高，为3.51%，其次为6种半活体营养型真菌，平均比例为2.56%，而6种死体营养型真菌和3种模式生物平均比例最低，分别为1.78%和1.36% (图 4)。由此可见，不同营养方式真菌中所具有的分泌蛋白有所不同，而造成以上菌株分泌蛋白含量的差异还有待进一步研究。

对上述真菌中分泌蛋白具有的功能进行分析，结果显示，上述19种菌株的5427个分泌蛋白共具有861种功能，具有共同功能的蛋白种类有152种，蛋白数量为4718个，其中有31种功能具有5个及5个以上的蛋白，所具有的蛋白数量为4418个；非共同功能的蛋白种类有709种，蛋白数量为709个(图 5)。

进一步对不同营养型真菌中分泌蛋白所具有的功能分析，结果显示，不同营养型真菌中分泌蛋白的功能种类数量不同，活体营养型真菌所具有的种类数量居多，其次为半活体营养型真菌、死体营养型真菌、模式生物。具体而言，在4种模式生物375个分泌蛋白中，共具有100种功能，其中假设蛋白有236个，预测蛋白有25个，非特征蛋白有13个，其余功能仅具有1或2个蛋白(图 6-A)；在6种死体营养型真菌的1363个分泌蛋白中，共具有128种功能，其中假设蛋白有844个，非特征蛋白有133个，预测蛋白有116个，保守假设蛋白有50个，糖苷水解酶家族-1蛋白有15个，内切葡聚糖酶-4蛋白有9个，果胶酸裂解酶B蛋白有6个，其余功能仅具有1至5个蛋白(图 6-B)；在6个半活体营养型真菌2248个分泌蛋白中，共具有266种功能，其中假设蛋白有1153个，非特征蛋白有662个，糖基水解酶家族-1蛋白有16个，果胶酸裂解酶蛋白有15个，含CVNH结构域的蛋白、真菌纤维素结合域蛋白、分泌蛋白各有8个，LysM结构域的蛋白含有7个，其余功能仅具有1至6个蛋白(图 6-C)；4活体营养型真菌的1441个分泌蛋白中共具有433种功能，其中非特征蛋白有821个，假设蛋白有142个，糖苷水解酶家族-7蛋白有7个，BgtE-200.1蛋白和糖苷水解酶家族-5蛋白各有5个，BgtE-59.1蛋白和效应家族蛋白各有4个，其余功能仅具有1至3个蛋白(图 6-D)。

近年来，国内外学者对植物病原菌中分泌蛋白和碳水化合物活性酶、效应分子等的研究已经成为植物病理学研究的重点和难点[7]。随着诸多植物病原菌全基因组序列的释放，为学术界深入开展上述病原菌致病基因的研究提供了重要的数据支撑。前期，包括本研究小组在内的诸多国内外学者对植物生物(如真菌[10, 15, 17, 27-28]和卵菌[29])分泌蛋白进行了大量的生物信息分析和预测工作，以及对枯草芽孢杆菌[30]、细菌性黑斑病菌等植物病原细菌的分泌蛋白展开了预测工作[22]。各类植物中的不同真菌和细菌及卵菌中所含分泌蛋白的数量和所占比例是不完全相同的[26]。其中，植物病原真菌分泌蛋白占总蛋白的比例约为3.65%-9.58%[31-32]，且不同活体营养型病原菌之间存在着一定差异；不同卵菌中含有的分泌蛋白占总蛋白的比例约为2.96%-4.01%[31]；不同细菌中分泌蛋白占总蛋白的比列约为5.05%-5.41%[22]。在褐环乳牛肝菌[33]、粘绿木霉[34]、里氏木霉[35]等非病原菌中分泌蛋白占总蛋白的比例为1.79%-3.89%。由于真菌测序费用相对较高，学术界选择同一种真菌的不同个体方面开展全基因组测序的报道不多，而对于同一种细菌的不同个体则开展了较多的测序报道。同时，前期本研究小组选择黄单胞菌[36]、细菌性黑斑病菌[22]等同一种细菌不同个体之间的分泌蛋白开展预测研究，明确了黄单胞菌和细菌性黑斑病菌等同一种细菌中不同个体之间所含的分泌蛋白在氨基酸及组成、信号肽特征方面的差异并不大，且分泌蛋白所占比例也较为相似。此外，学术界对植物病原真菌中分泌蛋白的预测及分析多针对于单种或者多种真菌开展研究工作，尚未见到关于同一种真菌不同个体之间分泌蛋白的预测及对比分析，有待于今后进一步深入研究。

本研究通过对模式生物、死体营养型真菌、半活体营养型真菌及活体营养型真菌共19种真菌的分泌蛋白开展预测及分析，明确分泌蛋白数量为58-712个，占总蛋白数量的0.74%-4.83%，活体营养型真菌所具有的分泌蛋白数量所占总蛋白数量的平均比例高于半活体营养型、死体营养型真菌以及模式生物，且死体营养型真菌和模式生物分泌蛋白数量所占总蛋白数量的平均比例仅为1.78%和1.36%。活体营养型真菌具有的功能种类最多，其次为半活体营养型真菌，而模式生物具有的功能种类最少，同时功能为假设蛋白和非特征蛋白的蛋白含量最多，在模式生物和死体营养型真菌中具有预测蛋白功能的蛋白也具有较高的含量。

一般而言，植物病原真菌在实现成功侵染植物过程中，经历了克服植物固有防御反应、基础免疫反应以及系统免疫等一系列防卫反应，从而实现对寄主植物的侵染、定殖以及系统操控等。分泌蛋白作为病原真菌克服寄主植物免疫反应过程中重要的“武器”，在实现上述过程中特别是基础免疫反应方面发挥着重要的作用。本研究发现不同营养方式真菌在分泌蛋白数量方面存在着较大的差异性，活体营养型真菌中分泌蛋白数量明显高于半活体、死体营养型真菌，同时，不同营养方式个体中也存在着差异，对于活体营养型真菌而言，其分泌蛋白所占比例最小的为U. maydis，数值为2.33%，最大为B. graminis，数值为4.83%；而就半活体营养型真菌而言，其分泌蛋白所占比例最小的为F. oxysporum，数值为1.83%，最大为P. oryzae，数值为3.93%；对于死体营养型真菌而言，其分泌蛋白所占比例最小的为S. sclerotiorum，数值为0.74%，最大为B. maydis，数值为2.37%。此外，不同寄主植物中所具有的固有防御反应、基础免疫反应以及系统免疫不尽相同，不同营养方式植物病原真菌在克服上述防卫反应方面也具有不同的强度特征。通过上述分析，明确不同营养方式植物病原真菌之间乃至同一营养方式植物病原真菌不同个体之间，在分泌蛋白数量及比例方面均存在着一定的差异性，因此，推测活体营养型真菌需要更多数量的分泌蛋白及更大表达量的分泌蛋白，从而实现其对于寄主植物免疫系统的操控作用。同时，由于存在着基因组注释程度的差异，可能导致分析结果受到影响，本研究仅明确分泌蛋白数量及功能方面存在差异性，尚未明确分泌蛋白表达量方面是否存在差异性，有待于今后进一步明确。此外，结合前人的研究成果，明确植物病原真菌、卵菌以及细菌等不同物种之间，甚至在同一群体不同物种之间以及同一属真菌不同种之间，所含有的分泌蛋白比例存在着一定的差异，这为未来学术界进一步开展不同物种、不同群体以及同一物种不同种之间分泌蛋白的功能共性化和差异化研究提供了重要的参考。