TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用，与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质。TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

TRIzol试剂可用于小量样品（50～100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。

分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western Blotting。

规格：100ml 黄色透明液体

储存条件：2～8℃避光保存12个月

注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。

预防RNase污染注意事项：

1.经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。

3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。

4.配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01℅v/v，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。

RNA的提取

准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。

操作步骤：

1. 匀浆处理：

a.组织将组织在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞　直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c.细胞悬液离心收集细胞，每5～10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1mlTRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2.将匀浆样品在室温（15～30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3.可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2～8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

5. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

6. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

7. 2～8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

8. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2～8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。

9.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5～10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25～200μl无RNase的水或0.5℅SDS，用枪头吸打几次，55～60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。

注意事项：

1.从少量样品（1～10mg组织或102～104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800mlTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5～10μgRNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2～8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30～60分钟。

预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：肝和脾6～10μg ，肾3～4μg ，骨骼肌和脑组织1～1.5μg ，胎盘1～4μg ，上皮细胞8～15μg ，成纤维细胞5～7μg 。

常见问题分析：

得率低：

A.样品裂解或匀浆处理不彻底。

B.RNA沉淀未完全溶解。

A260/A28012000×g离心10分钟除去。

DNA的定量：取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数，人、大鼠、小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1μg，6.5μg，5.8μg。

预期产量：1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝和肾3～4μg 骨骼肌，脑组织，胎盘2～3μg 人，大鼠，小鼠培养细胞（1×106）5～7μg 成纤维细胞5～7μg。

应用：

1.用于PCR溶于8mMNaOH的DNA用0.1M HEPES调pH至8.4，取0.1～1μgDNA用作模板。

2.酶切反应用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每μg DNA使用3～5单位的酶，80～90%的DNA是可消化的。

1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节

Final pH 0.1M HEPES（μl）Final pH 1M HEPES（μl）

8.4 86 7.2 23

8.2 93 7.0 32

8.0 101

7.8 117

7.5 159

注意事项：

1. DNA在中间层和有机相中时可在2～8℃保存过夜。

2.DNA沉淀在75%乙醇中2～8℃可保存几个月。

3.DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7～8并且加EDTA至1mM，可置于4℃或-20℃长期保存。

常见问题分析：

得率低：

A.样品匀浆和裂解的不彻底。

B.最终得到的DNA沉淀没有完全溶解。

A260/A280