电穿孔转化感受态E.coli TG1细胞的制备 |
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一、材料和试剂 恒温旋转式摇床 三角烧瓶（容量为1或2L） 50ml灭菌离心管 低温高速离心机 SB培养基 细菌培养用胰化蛋白胨 20g 细菌培养用酵母提取物 5g NaCl 0.5g 去离子水 950ml 250mmol/L KCl溶液 10ml以5N的NaOH调节溶液的pH值至7.0，加去离子水至1L，高压蒸气灭菌。 20%葡萄糖溶液 1mol/L MgCl2溶液 10%甘油二、操作步骤 从新鲜的LB平板培养物中挑选一个TG1克隆，接种于10m1 SB培养基中。 37℃摇床培养过夜。 取2.5ml培养物转接于0.5L SB中，另添加10ml 20%葡萄糖和5ml 1mol/L MgCl2。 37℃培养直到OD600=0.7～0.8。 将培养物置于冰浴15min，然后4000r/min于4℃离心20min，弃上清。 将菌体重悬于1/2体积的预冷10%甘油中，4000r/min于4℃离心20min，弃上清。 重复第（6）步骤。 将菌体重悬于15ml 10%甘油，并转移至一支50ml的离心管中。3500r/min于4℃离心15min。小心地去掉上清，得到4～5ml细菌。迅速地将其吹打重悬； 分装成200μl或40μl 的小份，操作应在乙醇/干冰浴中进行。贮存于-70℃。 用pUC19质粒测试制备感受态细菌的转化效率，应达到109cfu/μg DNA。 |
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