最初的iPSC重编程研究利用逆转录病毒载体表达重编程因子。尽管逆转录病毒通常仅感染分裂细胞，但是由于逆转录病毒进入宿主基因组的途径取决于有丝分裂期间发生的核膜破裂，而慢病毒是逆转录病毒家族的一种，可以感染非分裂细胞。为了通过利用分裂细胞和非分裂细胞来提高重编程效率，汤姆森实验室是第一个成功证明在iPSC重编程中使用慢病毒的实验室。

尽管逆转录病毒和慢病毒载体被证明是iPSC重编程的强大载体，但这些递送系统的主要缺点是携带转基因的病毒基因组随机整合到细胞基因中。例如，整合位点可以是调控或结构元素。其次，整合到细胞基因组中的病毒基因组的拷贝数在实验之间可能会有很大的差异。重编程的iPSC中转基因的存在不仅可能阻碍其临床应用，而且可能在某些疾病建模和基因发现策略中引起关注。

2. 非整合重编程

1. 腺病毒

2008年发表于Science杂志的文章《Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration》报道使用腺病毒进行重编程。

文章通过使用瞬时表达Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的非整合腺病毒从成纤维细胞和肝细胞生成小鼠诱导的多能干（iPS）细胞。文章结果表明这些腺病毒iPS（adeno-iPS）细胞表现出重编程细胞的DNA去甲基化特征，表达内源多能性基因，形成畸胎瘤，并参与嵌合小鼠的多种组织。我们的结果提供了强有力的证据，证明体外重编程不需要插入诱变。

2. 仙台病毒

自1950年代分离以来，SeV作为基础生物学和应用生物学的研究工具一直占据着独特的位置。SeV是一种RNA病毒，它保留在被感染细胞的细胞质中（即宿主基因组中没有整合），并且可以稳健地表达重新编程的基因几代。但是，SeV很快被稀释，最终完全消失。

据报道，装有Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc cDNA的野生型SeV载体可产生无转基因的iPSC，这取决于通过细胞传代被动消除载体基因组。该原型被具有温度敏感（temperature-sensitive）突变的较小细胞毒性的骨架所取代，该突变有利于载体基因组的更快清除，并且现已可以商购。SeV重编程是高效、高度可靠的，并且可以处理许多不同体细胞类型的工作量，并且在大多数传代的较高品系中完全没有病毒序列。

3. 附加型质粒（episomal vector）

在基于游离质粒的重编程中，可通过基于oriP/EBNA1的游离载体实现重编程因子的延长表达。这些质粒包含Epstein-Barr病毒衍生的oriP/EBNA1病毒元件，oriP/EBNA1元件可促进游离质粒DNA在分裂细胞中的复制，因此允许重编程因子表达足够长的时间以启动重编程过程，质粒最终会从增殖细胞中丢失，不会留下质粒转染的足迹。

4. mRNA

在mRNA重编程中，细胞被编码重编程因子体外转录的mRNA转染。然而，该策略需要减轻由于引入合成核酸而在细胞中引起的强烈免疫原性应答。文章《Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA》报道了第一个成功基于合成mRNA的重编程。

文章采用了几种措施来限制外源核酸对先天免疫系统的激活。他们用5-甲基胞苷代替胞苷，假尿苷代替尿苷，修饰RNA碱基，然后将干扰素抑制剂加入细胞培养基。RNA方法的主要优点是细胞集落出现的速度，相对较高的重编程效率，完全没有整合，非常低的非整倍性率和低的供体细胞需求。但是，由于mRNA的半衰期非常短，因此需要每天转染以诱导iPSC，这会大大增加动手时间和总体工作量。该方案还需要带有氧气控制的组织培养箱。更重要的是，RNA重编程显示不同样品的成功率很低。

总 结

仙台病毒或腺病毒、附加型质粒（episomal）或小环（minicircles），用重编程的mRNA或蛋白质直接转染，以及使用piggyBac转座子转座，这些方法都不会整合到细胞基因组中。尽管每种方法都有其独特的功能，但生成iPSC的主要要求是强效和可重复性。这些非整合重编程方法中的一些要么重编程效率差（腺病毒和蛋白质），要么在重编程除成纤维细胞以外的任何体细胞中均无效【小环（minicircles）】，或者需要对载体序列进行重编程后再去除（piggyBac）。

有文章表明，基于仙台病毒（SeV）的方法最能满足这种要求。在严格的良好生产规范（GMP）制造条件下，此方法已显示出成功产生患者专用iPSC的能力。另外，与仙台病毒相比，由于游离型载体的简便性和其能够从iPSC的快速清除，游离型载体也许更容易用于临床级应用。

上述图片来自Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Disease Modeling and Precision Medicine

5. 小分子化合物重编程

邓宏魁研究组在Science杂志上发表的文章《Pluripotent Stem Cells Induced From Mouse Somatic Cells by Small-Molecule Compounds》报道了重大突破，他们首次利用小分子化合物将体细胞重编程为多潜能干细胞（chemically iPSC, CiPSC）。

这项成果提供了更加简单和安全有效的方式来重新赋予成体细胞“多潜能性”，开辟了一条新的途径实现体细胞重编程，为未来细胞治疗及人造器官提供了理想的细胞来源，给未来应用再生医学治疗重大疾病带来了新的可能。

1. Flow cytometry

使用流式细胞仪检测多能性标志物，例如TRA-1-60和SSEA-4。

2. 碱性磷酸酶（ALP）染色

在12孔板中培养iPSC，以形成典型的iPSC克隆，然后通过碱性磷酸酶（ALP）染色检测干细胞的特征，并可视化相应图像。

3. 细胞增殖测定

消化、计数每一代细胞，并将其接种到96孔板中，并稀释至2×103细胞/ ml的浓度。将细胞铺在三个平行的孔中，并进行常规培养。使用细胞计数试剂盒测定细胞增殖，并绘制生长曲线。

4. 多能性标志物表达的检测

通常，人iPS细胞不表达阶段特异性胚胎抗原（SSEA）-1。相反，他们表达了hES细胞特异性表面抗原，包括SSEA-3，SSEA-4，肿瘤相关抗原（TRA）-1-60、TRA-1-81和TRA-2-49 / 6E（碱性磷酸酶） 和NANOG蛋白。

5. 干细胞相关基因的检测

人类iPS细胞表达了许多未分化的ES细胞标记基因，例如OCT3/4、SOX2、NANOG、生长和分化因子3（GDF3）、表达降低基因1（REX1）、成纤维细胞生长因子4（FGF4）、 胚胎细胞特异性基因1（ESG1）、发育多能相关基因2（DPPA2）、DPPA4和端粒酶逆转录酶（hTERT）的水平等于或高于hES细胞系H9和人类胚胎癌细胞系NTERA-2中的水平。

6. 诱导多能细胞染色体核型分析

染色体G带核型分析结果表明，所有iPSC均显示出正常的核型，表明当LIC诱导为iPSC时没有染色体畸变。下图结果是在超过十代的细胞培养中，所有iPSC均显示出正常的核型。

其他检测方法有胚状体中三个胚层的分化分析和畸胎母细胞瘤形成的检测，前者通常用Qpcr检测不同胚层标志基因的表达水平，后者通过动物实验确定。上述鉴定根据具体是实验确定，有些文章中并没有使用全部鉴定方法。

诱导多能干细胞（iPSCs）可以在细胞水平上研究人体生理学和疾病，还具有在精密医学实践（例如个性化药物测试）中被利用的潜力。它们在心血管疾病模型、精密医学中的用途以及推广，使其在生物医学应用领域应用广泛。

人类iPSC的特性使其具有独特的特性，可作为研究人类疾病的模型系统：它们起源于人类，这意味着它们携带人类基因组；它们是多能的，这意味着从原则上讲，它们可以分化为人体的任何体细胞类型。它们是干细胞，这意味着它们可以从单个细胞扩增成数百万甚至数十亿个细胞后代。iPSC提供了研究与个别患者遗传匹配的细胞的机会，而基因组编辑工具允许引入或纠正遗传变异。使用iPSC更好地了解心肌病，心律失常，瓣膜和血管疾病以及缺血性心脏病。

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