SPDP交联剂 |
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SPDP试剂是一组独特的，胺和巯基反应性的异双功能交联剂。无论是分子间胺-胺或者胺-巯基交联，SPDP试剂都会产生二硫键，后期可以用还原剂如二硫苏糖醇（DTT）进行切割。 SPDP试剂的胺反应性部分是N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯。反应最常于PH7～8的磷酸盐，碳酸盐/碳酸氢盐或硼酸盐缓冲液中进行。水解降解的反应速率会随pH值的增加而加快，例如，NHS酯的半衰期在pH7下为几个小时，在pH9下小于10分钟。如SPDP的NHS-酯试剂水溶性有限，必须先将它们溶解在有机溶剂中，然后稀释加入反应混合物中。 SPDP试剂的巯基反应性部分是2-吡啶基二硫基，其在pH7～8.1之间与巯基反应最佳。反应置换吡啶-2-硫酮基团，其浓度可以通过测量343nm处的吸光度（参见附加信息部分）。反应缓冲液不能含有硫醇和二硫化物还原剂，直到反应需要猝灭或还原2-吡啶基二硫化物。 可以使用两种基本方法来形成蛋白质与SPDP试剂之间的可切割交联，取决于一种或两种蛋白质除了伯胺之外已经具有巯基（-SH）（图2）。两种偶联方法都在间隔臂中产生二硫键，其可以通过二硫苏糖醇（DTT）或其它还原剂还原来切割。在大多数情况下，使用SPDP试剂产生的交联可以在pH4.5用25mM DTT切割，而不降低天然蛋白质二硫键但若不需要保护蛋白质的天然二硫键，可以在pH7～9下最有效地进行DTT的切割。 图2.SPDP试剂交联两种蛋白的机制。如果一个蛋白质已经含有巯基，那么只有一种蛋白质必须被SPDP试剂修饰，只有A和C反应。如果两种蛋白质都不含有可用的巯基，则用SPDP试剂（反应A）分别修饰两种蛋白质，其中一种蛋白质用还原剂处理以暴露巯基（反应B），最后交联两种蛋白质（反应C）。 英文名称：N-succinimidyl3-(2-pyridyldithio) propionate 分子量：312.37间隔臂：6.8Å纯度：＞95%(TLC)保存：-20℃结构式： 一、交联两种蛋白质的方法，其中一种含有巯基为了形成蛋白A-NH2和蛋白B-SH的交联，蛋白A-NH2用SPDP试剂进行修饰，然后脱盐除去反应副产物和过量的未反应试剂，纯化SPDP修饰的蛋白A-NH2，接着加入含巯基的蛋白B-SH来制备最终的交联物（图2，反应A）。 需要材料水混溶性有机溶剂如二甲基亚砜（DMSO）或二甲基甲酰胺（DMF），不需要Sulfo-LC-SPDP。含EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS-EDTA）：100mM磷酸钠，150mM NaCl，1mM EDTA，0.02%叠氮化钠，pH7.5。脱盐柱，足以处理1～2mL样品。待交联的蛋白质：在说明书中，IgG和β-半乳糖苷酶分别代表含有胺基和巯基的蛋白质。程序打开SPDP试剂瓶前先平衡至室温。立即使用前，准备20mM SPDP试剂溶液将2mg试剂溶于320μlDMSO或DMF中。溶解2～5mg IgG在1.0mL PBS-EDTA中，加入25μL 20mM SPDP溶液。室温下孵育30分钟。用PBS-EDTA平衡的脱盐柱纯化SPDP修饰的IgG，去除反应副产物和过量的未反应的SPDP试剂。向IgG溶液中加入1～3mg β-半乳糖苷酶（β-gal/IgG摩尔比约1～3），并将反应混合物在室温下孵育过夜。蛋白质（本示例中的IgG和β-半乳糖苷酶）已交联。二、交联两种蛋白质的方法，都不含巯基为了形成蛋白A-NH2和蛋白B-NH2的交联，每种蛋白质都必须用SPDP试剂单独修饰。然后用还原剂还原一种修饰的蛋白质，并从中去除吡啶-2-硫酮基团，接着用脱盐柱去除还原剂，将所得的巯基修饰的蛋白质和SPDP修饰的蛋白质一起孵育，制成最终的交联物（图2）。 需要材料水混溶性有机溶剂如二甲基亚砜（DMSO）或二甲基甲酰胺（DMF），不需要Sulfo-LC-SPDP。含EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS-EDTA）：20mM磷酸钠，150mM NaCl，1mM EDTA，0.02%叠氮化钠，pH7.5。注：如果在C部分要使用乙酸盐缓冲液，则在该缓冲液中不要超过20mM磷酸钠。否则可以使用20～100mM磷酸钠。醋酸缓冲液：100mM乙酸钠缓冲液，100mM NaCl，pH4.5。脱盐柱，足以处理1～2mL样品。二硫苏糖醇（DTT）。两种待交联的蛋白质。SPDP分别修饰两种蛋白质打开SPDP试剂瓶前先平衡至室温。立即使用前，准备20mM SPDP试剂溶液将2mg试剂溶于320μlDMSO或DMF中。溶解2～5mg IgG在1.0mL PBS-EDTA中，加入25μL 20mM SPDP溶液。室温下孵育30～60分钟。用PBS-EDTA平衡的脱盐柱纯化SPDP修饰的蛋白质，去除反应副产物和过量的未反应的SPDP试剂。或使用透析盒透析样品，并使用浓缩溶液浓缩。至此两种蛋白质都经过SPDP修饰，其中一种蛋白质必须在交联之前被还原（C部分）。还原一种蛋白质中的SPDP二硫化物选择B部分中一种SPDP修饰的蛋白，选择其功能或活性最少依赖于天然二硫键的蛋白质。将23mg DTT溶于1mL乙酸盐缓冲液或PBS-EDTA中（制成150mM溶液）。使用乙酸盐缓冲液避免还原蛋白质中的天然二硫键。每1mL SPDP修饰的蛋白质中加入0.5mL DTT溶液（DTT终浓度50mM）。孵育30分钟。用PBS-EDTA平衡的脱盐柱，纯化蛋白质（现在是巯基修饰状态）来除去DTT和反应副产物。交联活化的蛋白混合SPDP修饰和巯基修饰的蛋白质，并在室温或4℃下孵育18小时。使用适合的排阻色谱法从两个未结合的蛋白质中分离交联物。三、确定SPDP修饰水平的方法 用PBS稀释100μL脱盐的SPDP修饰的蛋白至1mL。测量并记录蛋白质样品在343nm处的吸光度，PBS-EDTA为空白对照，（一式三份测试）。加入10μL 15mg/ml DTT至1mL SPDP修饰的蛋白质样品中，混匀。精确的15分钟后，测量并记录在343nm处的还原样品的吸光度。计算吸光度变化：ΔA343=（加入DTT后Ave.A343）-（加入DTT前Ave.A343）使用以下公式计算SPDP与蛋白质的摩尔比：ΔA×蛋白分子量＝SPDP/蛋白质的摩尔比8080蛋白浓度(mg/mL) 8080是吡啶-2-硫酮在343nm处的消光系数：8.08×103M-1cm-1相关搜索：SPDP交联剂，SPDP，3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，SPDP crosslinkers |
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