轮状病毒属于呼肠孤病毒科，其颗粒直径为70~75 nm，无包膜，双层衣壳，具有11个节段的双链RNA[1]。轮状病毒体核心RNA全长约为18.5 kb，编码11~12个蛋白，其中包括6个结构蛋白(VP1~VP4，VP6，VP7)和5个非结构蛋白(NSP1~NSP4，NSP5/NSP6)。轮状病毒有10种亚型(轮状病毒A~J)，其中轮状病毒A引起的感染占轮状病毒感染病例的90%以上[2]。在6个结构蛋白中糖蛋白VP7和蛋白酶敏感蛋白VP4位于外衣壳，是轮状病毒双重分类系统的依据[3]。在A组轮状病毒中，根据VP7抗原性不同可分为不同的G血清型，其中G1~G4在人群中最流行；根据VP4抗原性不同可分为不同的P血清型，以P1A型为常见型。在临床诊断和鉴别中，主要以病毒基因型分型作为诊断依据。G血清型与基因型的表述一致；P血清型与基因型表述不一致，基因型用中括号“[]”表示(如血清型P1A即为基因型P[8]，P1B即为基因型P[4]，P2A即为基因型P[6])。其中6个G型(即G1，G2，G3，G4，G9和G12)和3个P型(P[4]，P[6]和P[8])的轮状病毒感染率更高[4]。

传统的轮状病毒检测是运用电子显微镜(electron microscope，EM)和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测轮状病毒颗粒及其抗原，这类传统方法繁琐、检出率低且耗时很长，已经很少使用。目前，临床上检测轮状病毒主要采用胶体金免疫层析法(gold immunochromatography assay, GICA)和反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)。GICA满足了临床检测方法应简单、快速的要求；RT-PCR从基因层面检测轮状病毒，具有高特异性、高敏感性的特点。但是，GICA敏感性不足，当病毒载量较低或抗原发生突变时就会出现假阴性；RT-PCR反转录合成cDNA操作复杂、容易污染、扩增耗时较长。这两种方法也无法很好地满足当今临床对于轮状病毒实验室诊断以及病毒流行病学调查的需求。在实验室技术发展过程中，各种新技术或是几种方法的联合使用可更加方便、快速和可靠地诊断轮状病毒。其中，RT-PCR与叠氮溴化丙锭(propidium monoazide, PMA)染料结合可以避免反转录过程中容易被污染的缺点。不断发展的分子诊断技术如环介导等温扩增检测(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、基因芯片、基于核酸序列的扩增反应(nuclear acid sequence-based amplification，NASBA)等可以缩短检测时间，更高效地为临床轮状病毒诊断提供支持。在用于探索新病毒的各项技术中，新一代测序技术(next generation sequencing，NGS)和宏基因组学也是未来可以用于诊断轮状病毒的方法。此外，还有一些已经用于其他病毒检测的可靠、高敏感性、高特异性的检测技术如肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)、NASBA-CRISPR裂解法、适配子(aptamers)等，可能在未来会被改进并用于轮状病毒的检测。

轮状病毒传统检测技术是指针对轮状病毒诊断的一些经典实验技术，但由于无法满足临床上对病毒诊断快速、准确的要求而逐渐被取代。这些技术通常通过对病毒的可视化或检测病毒抗原来进行轮状病毒检测，比如运用EM对病毒进行可视化检测或运用ELISA检测病毒抗原。这类传统方法操作繁琐、检出率低且耗时很长，已经较少使用。

病原体鉴定的开创性工作始于在EM下对病毒进行可视化检测，EM观察简单准确。轮状病毒有典型的形态特征，其病毒呈球形、外层衣壳呈车轮条幅状，可在EM下进行观察检测。为了在实验室中培养轮状病毒，将诱导的类肠样人类肠道器官(induced human intestinal organoids, IHIO)与人类胚胎或诱导的多能干细胞系进行分化，可成功用于培养轮状病毒[5]，EM可以监测病毒的生长状态。此外基于抗原-抗体反应，轮状病毒抗原特异性标记的抗体检测到特异的抗原抗体复合物时，相比普通的负染技术，其敏感性提高100倍[6]。

在临床检测中，形态学检查会出现较多假阴性结果，主要原因有以下两点：①EM法敏感性较低，病毒颗粒浓度至少需要1×106 /mL，低病毒载量的样本难以检出[7]；②从样本收集到染色检测需要较长时间，轮状病毒颗粒易降解，会影响最后观察的准确性。另外，由于EM设备价格比较昂贵，维护成本较高，因此EM技术已不在临床检测中应用。

对于轮状病毒临床检测，利用免疫学检测技术来检测轮状病毒抗原可以更快地为临床诊断提供依据，且拥有较高的阳性率。ELISA是轮状病毒抗原检测采用最多的方法，其利用双抗体夹心法可根据检测目的设计不同的包被抗体和检测抗体，具有方便、价廉的优点。但由于粪便样本成分复杂，存在其他抗原成分干扰轮状病毒抗原、抗体结合，所以结果会有一定的误差。在这种情况下，ELISA非常容易出现假阳性，特别在出生10 d以内的新生儿中，假阳性率超过90%[8]。此外，ELISA结果会受到环境、试剂以及人员等外在因素的影响，且操作步骤较多、耗时长。因此，目前在临床上较少使用ELISA来直接检测轮状病毒抗原。

常规检测技术是临床上轮状病毒实验室诊断的主要方法，其在传统检测技术的基础上进行改进，以满足临床快速、准确的检测要求。目前临床检测轮状病毒使用较多的是GICA和RT-PCR。GICA以传统ELISA作为基础加入胶体金标记的检测抗体以检测轮状病毒抗原，该方法很好地克服了传统ELISA操作步骤较多、耗时长的缺点，商品化的试剂盒保证了检测的重复性和抗干扰性。近年来随着核酸扩增技术的发展，RT-PCR在临床的应用得到了认可，通过核酸扩增来检测病原微生物具有更高的敏感性和特异性[9]。针对轮状病毒，基因检测不仅能够快速诊断轮状病毒感染，更能得到轮状病毒具体的分型，并进一步分析基因型别的流行情况。

GICA是检测轮状病毒抗原的常用方法之一，在硝酸纤维膜上的检测区包被A群轮状病毒抗体，并用胶体金标记。样本中的病毒可与“胶体金-抗体”结合，形成免疫复合物。彭端亮等[10]使用A组轮状病毒诊断试剂(胶体金法)对1 970例粪便样本进行抗原检测，结果612例A组轮状病毒阳性，阳性率占31.07%。此法可在15 min内得到轮状病毒抗原检测结果，且不需要特殊仪器，适合在基层医院推广使用，有利于疾病的早期诊断、治疗和预防。GICA是目前临床上使用最多检测轮状病毒的方法，其在床旁检测、快速检测方面有着较好的应用前景。但与ELISA比较，GICA在敏感性上略低于ELISA [11]，因此敏感性不足是其缺点，当病毒载量较低或抗原发生突变时就会出现假阴性。

PCR从1985年的简易DNA扩增技术发展到现在的第3代技术，其最大的特点是具有强大的扩增能力与极高的敏感性，但实验很容易被污染，极其微量的污染即可造成假阳性产生[12]。用RT-PCR分别扩增轮状病毒VP7全基因组及VP4基因型特异性片段(11~887 bp)，以检测标本中是否存在轮状病毒感染。此法可检测储存时间较长的标本，且重复性、特异性都明显高于其他方法[11]。RT-PCR弥补了免疫学方法检测轮状病毒时出现的假阴性问题，但须进行病毒RNA的提取和cDNA的制备，扩增阶段需要近3 h，最后电泳鉴别还需要1 h。RT-PCR在反转录合成全长cDNA时反应容易中断，导致扩增效率不高[13]。该法操作难度高、容易污染出现假阳性且耗时长，无法很好地满足临床上准确、快速、可靠的检测要求，故而在临床检测上应用较少。但RT-PCR对轮状病毒G/P分型有着极高的特异性，在流行病学特征研究中使用较多。此外RT-PCR还可监测疫苗对特定亚型轮状病毒的防控作用[12]。综上所述，RT-PCR具有极高的敏感性，克服了免疫学方法在检测轮状病毒时假阴性高的缺点，但其操作复杂易出现污染而导致假阳性。

近几年一些技术与RT-PCR相结合以进一步提高此法的特异性，避免检测过程中出现污染导致结果出现假阳性。例如，为了区分轮状病毒和其他非传染性肠道病毒，将RT-PCR与PMA染料共用。这种方法是基于PMA染料可穿透受损的非传染性病毒衣壳，然后在可见光照射下与病毒RNA共价结合，从而令RNA无法通过RT-PCR进行扩增[14]这一原理设计的。此技术与RT-PCR联用很好地解决了RT-PCR操作难度高、易被污染的缺点，并发挥其高特异性的优点，使其可以鉴别轮状病毒和其他肠道病毒。Leifels等[15]在检测水样本中传染性和非传染性肠道病毒时，使用PMA与RT-PCR联用的方法，将轮状病毒A的检出率提高了5倍。

LAMP针对轮状病毒靶基因的6个区域设计引物，利用链置换DNA聚合酶可在几十分钟内获得大量DNA扩增片段，并通过简单观察就可以判断是否发生反应。LAMP扩增只须保持65 ℃，省去了温度调节的过程，使得检测成本和时间成本大幅下降[16]。相比于传统PCR，LAMP敏感性、特异性更高，能够满足临床检测的需要，并且不需要专用仪器，结果判读简单，非常适合现场流行病学调查和基层医疗机构分析腹泻病原体。

为了提高检测的敏感性，RT-LAMP可将轮状病毒的VP6和NSP4作为靶点进行检测，敏感度可达到1.12×104拷贝数/mL。最近开发出的一种基于试纸的LAMP(paper-LAMP)可在床旁进行轮状病毒检测，这项技术可在5 min内完成核酸提取，并在25 min内进行靶序列扩增，结果可直接肉眼观察，检出限为1×103拷贝数/mL。此法成本低、检测效率高，未来会在临床检查和床旁检测中大量应用[17]。

基因芯片是一种微型化、高通量的自动化检测技术，目前研发的轮状病毒基因芯片多用于毒株的分组、分型及新病毒株的鉴定等研究，临床上基因芯片可同时检测包括HIV、轮状病毒在内的多种病原体[18]。

xTAG® GPP是基于Luminex的xTAG技术，可同时检测包括病毒和细菌在内的15种腹泻病原体基因的检测试剂盒[19]。总体上，xTAG-GPP对这些病原体的敏感性(96.3%)和特异性(99.8%)较高，其中对于轮状病毒的敏感性和特异性均达到了100%[20]。因此，xTAG-GPP可广泛应用于临床上感染性腹泻的病原体检测。由于其可同时检测多个目标病原体，缩短了标本的检测时间，故而能够及时为临床提供诊断结果。

微流控芯片是一种基于快速多重PCR的新型检测技术。膜芯片FilmArray微流控芯片(生物梅里埃，法国)可对导致胃肠道感染的22种常见病原体同时进行检测，轮状病毒是其中之一，只需要1 h便能得出检测结果，且该检测由仪器自动完成，根据不同病原体扩增产物的熔解曲线和熔解温度Tm进行判断[21]。

NASBA是由1对引物介导、连续均一的体外特异性核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程，扩增温度为41 ℃，可避免双链DNA污染。NASBA不需要PCR仪，在一般实验室内即可完成，而敏感性高于PCR。由于反转录过程被直接合并到扩增反应中，NASBA检测轮状病毒这类RNA病毒有优势。在标准条件下，这项测试能在4小时左右完成，检测速度快[22]。NASBA为等温扩增技术，且可以采用杂交检测系统和寡核苷酸检测系统，所以其特异性和敏感性都很高。其中，多重RT-NASBA技术对轮状病毒的检测比RT-PCR敏感10~100倍，且用时更少[17]。但NASBA技术检测成本高，大多处于研究阶段。

NGS可用于了解病原体在分子流行病学层面的传播特征。相比于以往分子诊断多针对目标基因进行分析，NGS可在一次测试中检测到临床样本中可用的大量基因数据，从而获取更多信息[17]。因此，它和其他分子诊断技术的联合使用打开了病原体诊断的新局面。NGS从开始的焦磷酸合成测序法到后来的合成测序法，再到现在最新的纳米孔技术，其效率、读取量均有提高。基于宏基因组学的发展，通过对轮状病毒感染暴发期间的全基因组测序来了解其遗传关系，为轮状病毒的分型及突变的诊断提供了更多可能[23]。但NGS成本高，不适用于一般的临床检测。

临床上对于病毒检测还有许多可靠、高敏感性、高特异性的检测技术，但这些技术目前还没有被用于轮状病毒的检测。未来这些技术可能会被改进并用于轮状病毒的检测。

PNA是一种合成的寡核苷酸，由于其本体的DNA糖磷酸酯骨架被氨基酸替代，所以它既具有核酸的特性，又具有氨基酸的特性。PNA在临床微生物检测上已有一些应用，比如基于PNA的荧光探针原位杂交技术可用于检测乙型肝炎病毒。PNA探针具有无结合链间斥力、结合稳定度高、易发现链间错配等优点，且实验耗时短，结果可通过荧光显微镜进行观察，故具有较好的临床推广可行性，可为轮状病毒的实时检测提供技术支持[17]。

NASBA-CRISPR裂解法利用裂解时CRISPR/CAS9核酸酶活性来检测病毒。NASBA-CC会影响Cas9在NGG前间区序列邻近基序附近切割。利用这个特性，在存在病毒RNA的情况下，扩增引物和全长RNA序列会激活受体H，而截短的RNA不会激活。这种方法已经被用于检测寨卡病毒，是一种对有这一特征的病毒低成本快速检测的方法[24]。

适配子是一段寡核苷酸或多肽，具有抗体的特异性并兼具耐热性和经济性，更适合用于医疗条件较差地区的检测。近几年，适配子作为抗体的替代品受到了极大的关注。适配子可与RT-PCR联用，和ELISA一样，可对适配子形成的复合物进行免疫吸附分析。最近，设计的一种基于原位捕获RT-qPCR方法的适配子被用于临床样本中诺如病毒的检测，检测下限可以达到800拷贝数/mL[25]。

PNA生物传感器可以从临床样本中直接提取出目标病毒的基因组DNA。NASBA-CRISPR裂解法以及适配子技术，目前已应用于寨卡病毒及诺如病毒的检测，这两项技术相较于常规基因检测技术在确保特异性和敏感性的同时，可以做到低成本、快速检测。这些技术的应用可大力推动轮状病毒检测从传统实验室检测发展到床旁检测、实时检测，为临床诊断轮状病毒感染提供高效、可靠的依据；还可为监测病毒突变及流行情况、了解疫苗有效率等提供新的技术方向。

病原体的实验室诊断技术发展很快，但临床上仍然缺乏可广泛使用、价格低廉、操作简便的方法。此外，临床上混合感染的情况较多，这也成为目前实验室诊断发展的一个障碍，无论是病原体形态学检查、免疫学检查还是基因检测技术都存在不足。而对于发展前景最好的基因检测技术来说，选择正确的目标靶位是检测成功的关键。未来的检测技术会向床旁检测、实时检测等方向发展，不断改进的LAMP就可很好地用于床旁检测。这些先进的技术均有助于更好地鉴定导致病毒性胃肠炎的病原体，不仅可为临床提供有价值的诊断报告，而且可以在病毒流行病学、疫苗研发等方面起着重要作用。