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作者：

徐亦淳

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摘要：

生物细胞中的蛋白表达被证明受到多种因素调控,其中密码子偏好一直以来都是决定蛋白翻译速率的重要因素.近年来随着密码子偏好机制的研究的不断深入,编码基因的密码子选择被证明还对翻译以外的多种层面如转录,蛋白共翻译折叠等有重要意义.毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统凭借众多优势,被广泛应用于表达外源重组蛋白.而在工程应用中,外源基因的密码子优化是常见的第一步骤策略.本课题的研究目的在于挖掘毕赤酵母具有何种独特的密码子偏好,以及这些偏好性的生物学意义.本课题首先根据毕赤酵母基因组信息和RNA-seq结果计算了 tRNA适应指数(tRNA adaption index,tAI),密码子使用频率(Codon usage index,cui),同义密码子相对使用频率(Relative synonymous codon usage,RSCU)和密码子适应指数(Codon adaption index,CAI)等参数.通过比较多个物种中tAI和cu,的相关性,揭示毕赤酵母基因组相对更偏好使用高翻译速度的密码子.接下来对广泛应用于毕赤酵母分泌表达的α信号肽进行密码子优化与去优化实验,融合表达报告蛋白淀粉酶(aF-AmyA)以比较分泌效率.我们发现N端大量稀有密码子的使用会降低整体蛋白表达量,但是N端前20个密码子若选择最优密码子,对蛋白表达的贡献却不大.此外,α信号肽的密码子选择对分泌效率影响不大.比较毕赤酵母和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组中稀有密码子的使用频率,发现与酿酒酵母相比,5'端偏好稀有密码子的区域长度较短.除信号肽区域外,我们也分析了非信号肽区域的密码子选择对基因表达及功能的影响.根据毕赤酵母基因组CAI的分布,我们选择了三个低CAI,高二级结构混乱度的基因,PAS_chr2-2_0376(EAF7),PAS_chr2-1_0233(RRM)和PAS_chr2-2_0432(ATG13)作为研究对象.根据毕赤酵母基因组的CAI参数,设计了密码子优化序列opt-EAF7,opt-ATG13,optC-ATG13,opt-RRM和optC-RRM,并构建PGAP驱动的转基因表达菌株.我们发现密码子偏好不同程度地调控了它们的mRNA水平和蛋白水平,并且对蛋白结构有调控作用.作为一种正在快速发展和兴起的底盘细胞和表达系统,越来越多的学者使用毕赤酵母表达外源蛋白或基因簇,外源基因的密码子优化是基因成功表达的第一步.本课题发现毕赤酵母基因组显著偏好优化密码子,同时,稀有密码子在某些基因中起到了调控基因表达和蛋白结构的作用.本课题对密码子工程基础上的毕赤酵母表达系统优化有重要意义.

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