本发明涉及制备靛蓝胭脂红(indigocarmine)分子的新方法，该方法使得可以实现高纯度，同时操作非常简单且具有高的产率。

背景技术：

靛蓝胭脂红，也称为5,5'-靛蓝磺酸二钠和3,3'-二氧代-2,2'-双(吲哚啉)-5,5'-二磺酸二钠(cas#860-22-0)，已知可作为染料用于食品、制药和化妆品领域，以及用于印刷和摄影领域(r.w.sabnis,handbookofbiologicaldyesandstains,2010,wileyandsons,page239)。在食品领域，靛蓝胭脂红是规范的主题，已在efsajournal2014；12(7):3768中报道。在制药领域，它特别用于染色组织，用于检测某些肿瘤细胞。5,5'-靛蓝磺酸二钠通常由靛蓝或2-(1,3-二氢-3-氧代-2h-吲哚-2-亚基)-1,2-二氢-3h-吲哚-3-酮(cas#：482-89-3)根据以下方案1中总结的反应获得：

方案1

然而，在该反应过程中，通常形成单-、二-、三-或四磺化(主要在5、5'、7、7'位)的其他化合物。

5,5'-靛蓝磺酸二钠

二磺化的异构体以大的量存在，并且它们的物理化学性质与靛蓝胭脂红非常相似。二磺化的分子的结构相似性使它们难以分离。对于医学或诊断应用，二磺化的异构体的存在具有将不希望的污染物引入患者体内的缺点。sung-hoonkimetal.,koreanj.anesthesiol.2011nov；61(5):435-438描述了低血压患者病例，其中向患者施用了含有杂质的靛蓝胭脂红。这些副作用归因于杂质。

因此，本发明的目的是开发一种制备基本上不含杂质，特别是二磺化杂质的5,5'-靛蓝磺酸二钠的方法。寻求开发一种能够获得符合食品领域的efsa要求和制药领域的标准ich(协调供人体使用的药品注册的技术要求的国际会议；ich协调三方指南-新药物中的杂质-q3a(r2)；第4步版本；2006年10月25日)的5,5'-靛蓝磺酸二钠的方法。ich标准规定，有效成分不应含有相对于活性成分大于或等于0.10％的未识别杂质。寻求开发一种快速、廉价、高效、高产率且易于在工业规模上放大的方法。

发明概述

本发明涉及制备5,5'-靛蓝磺酸二钠的方法，起始材料为靛蓝，该方法包括以下步骤：

i)对靛蓝进行磺化处理，得到含有5,5'-靛蓝磺酸的混合物，

该方法的特征在于：

ii)将步骤i)中获得的混合物进行还原处理，并任选地进行纯化步骤，以获得包含隐色-5,5'-靛蓝磺酸的组合物，

iii)从源自步骤ii)的组合物中分离出隐色-5,5'-靛蓝磺酸，

iv)将源自步骤iii)的隐色-5,5'-靛蓝磺酸氧化成5,5'-靛蓝磺酸二钠。

根据优选的实施方案，步骤i)的还原处理使用连二亚硫酸钠在水性介质中进行。

根据优选的实施方案，在步骤ii)结束时，从反应介质中沉淀出隐色-5,5'-靛蓝磺酸。

根据优选实施方案，步骤iii)包括以下至少一个步骤：

iiia)将源自步骤ii)的组合物进行过滤，

iiib)回收过滤器上保留的固体。

有利地，步骤iii)在步骤iiib)之后还包括至少一个步骤iiic)，该步骤iiic)包括用水性介质洗涤固体。

更有利地，将步骤iiic)应用一至五次。

根据优选的实施方案，在步骤iii)结束时获得的组合物包含相对于组合物的总摩尔数为至少90mol％的隐色-5,5'-靛蓝磺酸。

根据优选的实施方案，步骤iv)包括至少一个步骤iva)，该步骤iva)包括在氧化剂存在下用碱在醇介质中进行处理。

有利地，步骤iva)包括在氧化剂存在下用乙醇钠在乙醇中进行处理。

有利地，氧化剂是气态氧。

根据优选的实施方案，该方法在步骤iva)之后还包括至少一个步骤ivb)，该步骤ivb)包括用一种或多种醇和/或水性-醇溶剂进行一次或多次洗涤。

本发明还涉及上述方法在制备包含至少99.5％的5,5'-靛蓝磺酸二钠的组合物中的用途，该百分比通过高压液相色谱法在290nm处的检测来测量。

本发明还涉及上述方法在制备其中存在的杂质量不大于0.10％的组合物中的用途，该百分比通过高压液相色谱法在290nm处的检测来测量。

本发明还涉及制备包含5,5'-靛蓝磺酸二钠的药物或诊断产品的方法，该方法包括通过上述和以下详述的方法制备5,5'-靛蓝磺酸二钠和将5,5'-靛蓝磺酸二钠引入到药学上可接受的载体中。

本发明还涉及制备包含5,5'-靛蓝磺酸二钠的食品组合物的方法，该方法包括通过上述和以下详述的方法制备5,5'-靛蓝磺酸二钠和将5,5'-靛蓝磺酸二钠引入到与食品应用相容的载体中。

例如，后一种方法可涉及制备食品着色组合物或有色食品组合物。

令人惊讶地，本发明人已经观察到，通过靛蓝的磺化和应用还原处理获得的隐色-5,5'-靛蓝磺酸可以容易地与其二磺化的异构体分离，而5,5'-靛蓝磺酸和其酸形式或二钠盐形式的二磺化的异构体的混合物则难以分离。

隐色-5,5'-靛蓝磺酸

具体地，还原在这样的反应介质中进行，其中隐色-5,5'-靛蓝磺酸是难溶，而其污染物，特别是其二磺化的异构体，则可溶于该介质中。

通过这些中间产物的还原形式进行，因此允许以高产率进行有效分离。由此回收隐色-5,5'-靛蓝磺酸。然后可以对分离的产物进行氧化处理，以形成具有高纯度的5,5'-靛蓝磺酸二钠。

发明详述

步骤i)：靛蓝的磺化

起始材料是靛蓝或2-(1,3-二氢-3氧代-2h-吲哚-2-亚基)-1,2二氢-3h-吲哚-3-酮(cas#：482-89-3)。使靛蓝根据以下方案2进行磺化处理：

方案2：靛蓝的磺化反应

[1]该已知反应通常通过用硫酸处理来进行。例如，可以参考以下出版物：us-647280；tudorabaltacetal.,revistadechimie(bucharest,romania)(2012),63(6),618-620；iqbalt.shadietal.,chemicalcommunications(cambridge,unitedkingdom)(2004),(12),1436-1437；capron,f.(1863),bluesandcarminesofindigo:apracticaltreatiseonthefabricationofeverycommercialproductderivedfromindigo；philadelphia:h.c.baird(https://catalog.hathitrust.org/record/006218585)；vanessabiandaetal.,bulgarianjournalofscienceeducation,volume22,number1,2013；charlese.carraheretal.,journalofmacromolecularscience,volume15,issue51981,第773-785页；r.w.sabnis,handbookofbiologicaldyesandstains,2010,wileyandsons,第239页。

然而，本发明的方法不限于该反应的产物，并且可以应用于包含5,5'-靛蓝磺酸和5,5'-靛蓝磺酸的二磺化的异构体的任何组合物，无论其制备方法如何。

当起始组合物源自靛蓝的磺化时，除了5,5'-靛蓝磺酸和二磺化的异构体之外，它还可以包含靛蓝；单磺化、三磺化、四磺化的衍生物，以及该反应的副产物。然而，通常，这些其他衍生物通过已知方法除去，例如高压液相色谱(hplc)。

当起始组合物源自靛蓝的磺化时，其包含约60％至95％的5,5'-靛蓝磺酸和5至40％的二磺化的异构体，优选75至80％的5,5'-靛蓝磺酸和20至25％的二磺化的异构体，该百分比以相对于所有二磺化的分子的摩尔数之和的摩尔数给出。然而，本发明的方法可以应用于包含所有比例的异构体混合物的组合物。

有利地，为了实施本发明的方法，使用如下起始组合物，其中相对于起始组合物的总摩尔数，5,5'-靛蓝磺酸及其二磺化的异构体占至少90摩尔％，甚至更有利地至少95％，还更优选至少98％。

术语5,5'-靛蓝磺酸的“二磺化的异构体”是指具有靛蓝或2-(1,3-二氢-3-氧代-2h-吲哚-2-亚基)-1,2-二氢-3h-吲哚-3-酮结构的任何分子，在每个吲哚基团上带有磺酸或磺酸盐官能团的取代基。5,7'-靛蓝磺酸是5,5'-靛蓝磺酸的二磺化的异构体的实例。

步骤ii)：源自步骤i)的混合物的还原

在第一步中，将源自步骤i)的包含5,5'-靛蓝磺酸的混合物进行还原处理，得到隐色-5,5'-靛蓝磺酸和其他化合物的混合物。

有利地，使用连二亚硫酸钠作为还原剂进行该还原处理。或者，可以使用下列还原剂中的一种或另一种进行还原：砷化倍半硫化物(arsenicsesquissulfide)的混合物、亚硫酸氢钠的混合物、硫酸铁(ii)、锌；或者可以通过电解进行还原。

优选地，还原处理在水性介质中进行。

有利地，还原处理通过在40至60℃，有利地45至55℃的温度下进行加热来进行。

优选地，处理的总持续时间为30分钟至6小时，有利地为1小时至4小时。

优选地，在还原处理之后，在可以增加隐色-5,5'-靛蓝磺酸的含量的条件下纯化获得的组合物。值得注意的是，用有机溶剂萃取介质以除去某些污染物，例如还原的靛蓝。萃取可以用乙酸乙酯或任何其他适合于萃取非磺化的组分的溶剂进行。

步骤iii)：分离隐色-5,5'-靛蓝磺酸

在第二步中，将隐色-5,5'-靛蓝磺酸与反应介质分离。有利地，通过沉淀隐色-5,5'-靛蓝磺酸，然后过滤并回收固体，从而将隐色-5,5'-靛蓝磺酸与反应介质分离。

优选地，步骤ii)在如下的溶剂中进行，其中异构体隐色-5,5'-靛蓝磺酸发生沉淀。优选地，将异构体隐色-5,5'-靛蓝磺酸与包含它的水性组合物分离。有利地，分离在来自步骤ii)的反应介质中直接进行，任选在第一次纯化后，例如使用有机溶剂进行萃取。优选地，在步骤ii)结束时，在反应介质中沉淀出隐色-5,5'-靛蓝磺酸。

或者，如果步骤ii)的反应在其中可溶解隐色-5,5'-靛蓝磺酸的介质中进行，则可以向反应介质中加入水，或者加入交换溶剂，以沉淀出隐色-5,5'-靛蓝磺酸。

优选地，通过使得自步骤ii)的反应介质通过过滤载体来进行分离。例如，可以将来自步骤ii)的反应介质通过过滤器过滤，例如孔隙率3的过滤漏斗或复丝聚丙烯过滤纱布。有利地，将来自步骤ii)的反应介质进行热过滤，优选在40至60℃，有利地在45至55℃的温度下进行热过滤。

在这些条件下，固体的异构体隐色-5,5'-靛蓝磺酸被过滤器保留，而反应介质的其它组分可溶于步骤ii)的反应介质中，在过滤期间夹带在水相中。

有利地，该过滤可以通过包括将固体在有机溶剂(例如thf)中浆化并且过滤由此形成的糊剂的处理来完成。这种浆化使得可以改善隐色-5,5'-靛蓝磺酸的纯度。

根据本发明，有利地设想通过另外的纯化例如用水洗涤来完成隐色-5,5'-靛蓝磺酸的分离步骤，例如通过提取包含隐色-5,5'-靛蓝磺酸的水溶液的固相，这通过将水溶液加热至40至60℃，有利地45至55℃的温度，然后过滤由此制备的悬浮液来进行。在过滤器上回收的固体是隐色-5,5'-靛蓝磺酸。通过该额外的纯化步骤改善了其纯度。

有利地，用水洗涤隐色-5,5'-靛蓝磺酸的操作施用1至5次，甚至更有利地施用2至4次。

有利地，该洗涤可以通过包括将固体在有机溶剂(例如thf)中浆化并且过滤由此形成的浆料的处理来完成。这种浆化使得可以改善隐色-5,5'-靛蓝磺酸的纯度。

有利地，重复纯化处理直至获得具有预期纯度水平的隐色-5,5'-靛蓝磺酸。优选地，重复纯化处理，直至获得相对于组合物的摩尔数包含至少99mol％的隐色-5,5'-靛蓝磺酸的组合物。

隐色-5,5'-靛蓝磺酸是进行本发明的方法的必要中间体。

可以使用其他技术，例如高压液相色谱(hplc)，以从来自步骤ii)的反应介质中分离隐色-5,5'-靛蓝磺酸。然而，过滤的优点在于其为实用且有效的方法，该方法非常容易在工业规模上放大。

步骤iv)：隐色-5,5'-靛蓝磺酸的氧化

在第四步中，根据下面的方案3，通过合适的氧化处理将隐色-5,5'-靛蓝磺酸转化为5,5'-靛蓝磺酸二钠：

方案3：将隐色-5,5'-靛蓝磺酸还原成靛蓝胭脂红

有利地，该处理包括在氧化剂存在下用碱在醇介质中处理。优选地，在醇介质中和在氧化剂存在下，用醇钠处理隐色-5,5'-靛蓝磺酸。

优选地，在氧化剂存在下，在乙醇介质中用乙醇钠处理隐色-5,5'-靛蓝磺酸。优选地，进行热处理，有利地在40至60℃，甚至更有利地45至55℃的温度下进行。优选地，在氧化剂存在下，用0.5至2.5摩尔当量的醇钠，优选0.8至1.5摩尔当量的醇钠处理隐色-5,5'-靛蓝磺酸。甚至更优选地，在氧化剂存在下，用0.5至2.5摩尔当量的乙醇钠，优选0.8至1.5摩尔当量的乙醇钠处理隐色-5,5'-靛蓝磺酸。有利地，氧化剂选自o2、h2o2、khso5、fecl3。

优选地，氧化剂是气态氧，其可以纯的或与其他气体(例如大气氧)混合使用。优选地，处理的持续时间为30分钟至10小时，甚至更优选1小时至8小时，有利地2小时至6小时。

优选地，步骤iv)的处理之后是用一种或多种有机溶剂洗涤一次或多次。优选地，步骤iv)的处理之后是用一种或多种醇和/或水性-醇溶剂洗涤一次或多次，特别是用乙醇洗涤和/或用甲醇洗涤和/或用水和甲醇的混合物洗涤和/或用水和乙醇的混合物洗涤。

用途：

本发明的主题还有是上述方法在制备具有高纯度的靛蓝胭脂红或5,5'-靛蓝磺酸二钠中的用途。特别地，本发明涉及上述方法在制备包含至少99.5％，更优选至少99.7％的靛蓝胭脂红或5,5'-靛蓝磺酸二钠的组合物中的用途。为了评价材料组合物中靛蓝胭脂红的量，通过高压液相色谱(hplc)在290nm处的检测来测量该％，该方法使用150*4.6；5μmc18柱，用10mm磷酸钠缓冲液(ph3.0)+1mmtbacl/meoh(70/30→10/90)进行梯度洗脱。

本发明涉及上述方法在制备组合物中的用途，在该组合物中杂质量不大于0.10％，还更优选杂质量不大于0.05％。通过用与用于评价靛蓝胭脂红的量的相同方法进行杂质量的评价。

本发明的主题还有是上述方法在制备包含靛蓝胭脂红或5,5'-靛蓝磺酸二钠的药物或诊断产品中的用途。所述药物或诊断产品可以是适合于在这些应用中使用的任何形式。特别地，可以提及：包含1至1000mg靛蓝胭脂红的片剂或凝胶胶囊形式；包含浓度为0.1％-10％(质量)的靛蓝胭脂红的水溶液形式。除靛蓝胭脂红外，此类组合物还包含本领域技术人员熟知的赋形剂，例如柠檬酸和/或柠檬酸盐；磷酸盐缓冲剂；聚合物；纤维素衍生物；脂质。包含靛蓝胭脂红的制剂尤其在wo2011/107945和wo2010/018723中有描述。在药物和诊断应用中，通过本发明方法获得的靛蓝胭脂红具有高纯度的优点，这避免了将不适用于该应用的材料引入体内。

本发明的主题还有是上述方法在制备包含靛蓝胭脂红或5,5'-靛蓝磺酸二钠的食用色素中的用途。所述食用色素可以是适合于在这些应用中使用的任何形式，特别是粉末或水溶液形式。通过本发明的方法获得的高纯度靛蓝胭脂红使得可以使其确保其无害。

本发明的方法的效率使得可以获得具有降低成本的产品。

实验部分：

i-材料和方法：

1-原料和设备：

靛蓝购自fisherscientific公司，商品号为21213。纯度：94.8％，根据供应商的说明书。

纱布(过滤)：可从sefar公司获得，商品号为v-05-6-475k。

nutsche过滤器：直径280mm，35l，可从buchi公司获得。

2-分析方法：

机器：agilent

柱：kromasil150x4.6-5μm

检测：290nm

样品浓度：1000ppm

溶解样品的溶剂：90/10h2o/meoh

洗脱溶剂：10mm磷酸钠缓冲液(ph3.0)+1mmtbac1/meoh

ii-程序步骤：

1-靛蓝转化为5,5'-靛蓝磺酸：

将1.5kg靛蓝(5.72mol)置于10升反应器中，在搅拌下于室温下向其中加入6升96％浓度的h2so4水溶液。将混合物在70℃下保持3小时，持继搅拌。然后将混合物冷却至5℃。将混合物缓慢加入到60升反应器中，该反应器含有冷却至5℃的15升水。在1小时15分钟内加入混合物。向混合物中加入90ml辛醇，使所得混合物达到50℃。获得在反应介质中的固体悬浮液，其是包含5,5'-靛蓝磺酸的混合物。

2-还原包含5,5'-靛蓝磺酸的混合物：

由15升水和3.51kg85％的连二亚硫酸钠溶液制备连二亚硫酸钠水溶液。将由此制备的水溶液置于氮气下的滴液漏斗中。在搅拌下将连二亚硫酸钠水溶液加入到步骤1-得到的反应混合物中，同时将介质保持在50℃。经1小时加入连二亚硫酸钠水溶液。然后将混合物在50℃下搅拌约1小时。然后将7.5升乙酸乙酯加入混合物中，并将所得混合物在50℃下搅拌20分钟。该介质仍然是含有隐色-5,5'-靛蓝磺酸的悬浮液形式。

3-隐色-5,5'-靛蓝磺酸的分离：

然后将来自步骤2-的反应介质通过配备有v-05-6-475k纱布的nutsche过滤器进行过滤。

将残留在过滤器上的固体用4.5升四氢呋喃(thf)浆化，然后过滤液体。

4-洗涤隐色-5,5'-靛蓝磺酸：

将在步骤3-结束时残留在过滤器上的产物置于60升反应器中的30升水中。将整体在50℃加热30分钟，然后通过装有v-05-6-475k纱布的nutsche过滤器进行过滤。

将残留在过滤器上的固体用4.5升四氢呋喃(thf)浆化，然后过滤液体。

重复该洗涤，以便在相同条件下总共洗涤三次。获得1.8kg湿产物。估计干重：1.3kg。

5-将隐色-5,5'-靛蓝磺酸二钠转化为5,5'-靛蓝磺酸二钠

将步骤4-中获得的1.8kg产物悬浮在60升反应器中的26升乙醇中。加入1143ml含有21％(质量)乙醇钠(naoet)的乙醇溶液。将混合物升温至50℃并使反应介质经4小时空气喷射，同时将其保持在50℃。

在此期间结束时，通过烧结漏斗过滤反应介质，过滤后用5.2升乙醇洗涤。

6-洗涤5,5'-靛蓝磺酸二钠

将湿固体置于26升甲醇中，将整体在40℃下加热30分钟，然后通过烧结漏斗过滤，过滤后用5.2升甲醇洗涤。

该洗涤重复一次。

接下来，将湿固体置于13升水和13升甲醇的混合物中，将整体在60℃下加热30分钟，然后通过烧结漏斗过滤，过滤之后用3.9升甲醇洗涤。

将固体在通风烘箱中干燥。

得到1.05kg5,5'-靛蓝磺酸二钠，相对于该方法中使用的靛蓝总量，产率为39％。

iii-结果：

通过hplc经由上述方法分析获得的产物。根据测试(进行三次测试)，纯度评估为99.85％至99.95％。

发现，通过应用易于扩大至大规模且简单、廉价的方案，本发明的方法可以高产率获得高纯度的产物，且就获得的产品的质量(纯度)方面而言，结果是可再现的。