最近在学基因敲除，需要用同源重组的方法构建质粒。引物设计令我非常头大，一个设计改了六七回，晕，我太笨了哈哈哈。

下图是一个多片段同源重组引物设计示意图，应该是听清楚的，但其实我也不知道这样对不对？不对的话希望大佬赐教啊！

大概解释一下：上图使用的是双酶切同源重组（貌似这种方法还成为in-fusion或者steamless同源重组）。如果要steamless（无缝）插入多个片段，则：

1、对于第一个片段（从5'端开始）的For引物而言，需要包括（从5'端to3'端）：

1）质粒酶切位点top链5'端至少15bp（此为与质粒融合所需的同源臂）；

2）酶切位点

3）需要插入的片段的top链5'端至少15bp；

2、对于第一个片段（从5'端开始）的Rev引物而言，需要包括（从5'端to3'端）：

1）需要插入片段bottom链的5'端至少15bp

3、对于第二个片段（从5'端开始）的For引物而言，需要包括（从5'端to3'端）：

1）第一个插入片段top链3'端至少15个bp

2）需要插入片段的top链5'端至少15个bp

4、对于第二个片段（从5'端开始）的Rev引物而言，需要包括（从5'端to3'端）：

1）需要插入片段bottom链的5'端至少15bp

5、以此类推

6、对于最后一个插入片段的Rev引物，需要包括（从5'端to3'端）：

1）需要插入片段bottom链的5'端至少15bp

2）酶切位点

3）酶切位点bottom链5'端至少15bp

酶切位点一般软件会提供，自己查也行，注意For引物是top链，Rev是bottom链，但引物的写法都是从5‘-3’端。

注意退火温度。

我用的是snapgene，这个软件的好处是可以模拟pcr，模拟重组的质粒，比较直接。

希望大家一起讨论鸭！！！小白在此拜谢！！！