原创 冯碧云 上海儿童医学中心内分泌遗传代谢

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遗传病的诊断方法

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之前的系列科普已为大家介绍了何为遗传病，以及遗传病的分类及遗传模式等。

遗传病的诊断是开展遗传病防治工作的基础。由于体内遗传物质的改变，遗传病表型涉及身体的各个组织器官，因此遗传病的诊断工作如同侦破一个个复杂的“案件”，需从有限的临床资料中，找到“线索”，配合适当的诊断技术，从而找到最终的“真相”——遗传病的病因。

遗传病诊断包括临症诊断、症状前诊断、产前诊断、胚胎植入前遗传学诊断等，遗传病的诊断技术，从最初的“染色体条带”分析，到后来的“单个碱基对”分析，再至“人类基因组”，从宏观至微观的步步发展，让越来越多的遗传病得到早期诊断与治疗。

以下将对遗传病的诊断方法进行详细介绍。

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病史、症状、体征与系谱分析

与一般疾病相同，遗传病的诊断应由病史、症状、体征入手。由于遗传病多有家族聚集现象，由此病史的采集与系谱分析极为重要。最有效的方法是绘制系谱。系谱分析有助于判断遗传病的遗传方式，以区分某些表型相似的遗传病。简单的符号可清晰的展现某一家系的遗传病发病情况，绘制系谱是遗传病诊断的第一步。

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细胞遗传学检查

细胞遗传学检查，即染色体检查或称核型分析，随着显带技术的应用以及高分辨染色体显带技术的出现和改进，能更准确地判断和发现更多的染色体数目和结构异常综合征，还可以发现新的微畸变综合征。

①染色体显带技术

20世纪70年代前后发展起来的染色体显带技术是细胞遗传学的一大突破。最基本、应用最为广泛的是G显带——即制备中期染色体标本，用胰酶处理后以吉姆萨溶液染色，最后在光学显微镜下观察深浅相间的区和带。利用染色体显带技术，可以使许多疾病在染色体水平找到原发性改变，如肿瘤、发育缺陷、心血管疾病等。

②染色体原位杂交（chromosome in situ hybridization）

应用标记的DNA片段（标记物可以为生物素、地高辛、荧光等）与玻片上的细胞、染色体或间期核的DNA或RNA杂交，在这些核酸不改变原来结构的情况下，研究核酸片段的位置、相互关系，因此称为原位杂交。如用荧光染料进行标记，使探针杂交的区域发出荧光，及称为荧光原位杂交（FISH）。该项技术如同“钓鱼”般，可快速定位所研究核酸片段，具有快速、经济、安全、灵敏度高、特异性强等优点。

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生化检查

①酶/蛋白质缺陷的检测

遗传代谢病是一组先天性生化紊乱所致的疾病，属单基因病。目前已知的遗传代谢病中，多数为酶缺陷病。遗传代谢病是基因突变的结果，基因表达调控异常、基因缺失、基因点突变导致蛋白质缺如和结构异常或翻译后加工修饰缺陷等，即可导致酶蛋白的缺如或功能异常。

②代谢中间产物的检测

遗传代谢病的代谢过程发生紊乱后，其中间产物、底物、最终产物等代谢产物发生质和量的变化，例如，通过测定尿中苯丙酮酸或苯乙酸可诊断苯丙酮酸尿症。血和尿液由于易采集，及其方法学的不断改进，一直被检测者常规采用，被制成滤纸片和显色反应进行检测。

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基因诊断（gene diagnosis）

基因诊断又称为分子诊断，是指利用分子生物学技术，直接检测体内DNA或RNA在结构或表达水平上的变化，从而对疾病做出诊断。

①限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）

意为DNA顺序上发生变化而出现或丢失某一限制性内切酶位点，使酶切产生的片段长度和数量发生变化。例如镰状细胞贫血症可通过限制性内切酶酶切或结合基因探针杂交的方法将突变找出。

②聚合酶链反应及相关技术（polymerase chain reaction, PCR）

该技术通过变性、退火、延伸的循环周期，使特定的基因或DNA片段在短短的2-3小时内扩增数十万至百万倍，大大缩短了诊断时间。PCR常结合其他技术进行遗传病的诊断，如巢式PCR，多重PCR，PCR等位基因特异性寡核苷酸杂交，PCR-单链构象多态性，PCR产物变性梯度凝胶电泳等。

③DNA测序（DNA sequencing）

该技术是基因突变检测的金标准，适用于已知和未知突变检测，不仅可确定突变的部位，还可确定突变的性质。第一代测序技术包括Gilbert发明的化学降解法和Sanger发明的双脱氧测序法，目前最常用的是Sanger双脱氧测序法。第二代测序又称为高通量基因组测序，使用焦磷酸测序、DNA簇、可逆性末端终结或四色荧光标记寡核苷酸的连续连接反应为基础，能够在短时间内高效检测包含数亿碱基的序列，目前已广泛应用于全基因组测序、外显子组测序、转录组测序、小分子RNA测序以及长链非编码RNA测序等多方面。近年来，随着二代测序技术的成本逐渐降低，高通量基因组学技术已成为临床常用遗传病诊断技术。目前第三代测序技术也在研发中，相比第二代测序，三代测序的最大特点是单分子实时测序，具有快速、精确、低成本的优势。

④DNA芯片（DNA chip）

该技术基于DNA杂交的核酸检测技术，把上万种寡核苷酸或DNA样品密集排列在玻片、硅片或尼龙膜等固相支持物上，通过激光共聚焦荧光显微镜获取信息，电脑系统分析处理所得资料，一次微排列可对上千种甚至更多基因的表达水平、突变和多态性进行快速、准确的检测。常应用于已知突变检测，如非综合征性耳聋的基因诊断。

⑤变性高效液相色谱（denaturing high performance liguid chromatography, DHPLC）

该技术针对可能的未知单核苷酸多态性和突变的筛查技术，如常染色体显性遗传的Marfan综合征、隐性遗传的白化病、X染色体连锁遗传的Duchenne型肌营养不良及一些线粒体疾病和甲基化异常疾病。

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产前诊断&胚胎植入前诊断

1）侵袭性方法

①羊膜穿刺法（amniocentesis）

羊膜穿刺技术是在B超监视下，用注射器经孕妇腹壁、子宫到羊膜腔抽取羊水的方法。多于16-20周时进行，可对羊水中的胎儿脱落细胞进行体外培养，从而达到细胞增殖的目的，进而进行胎儿的染色体分析、生化检查和DNA诊断。该方法相对安全，但仍存在一定的并发症。

②绒毛取样法（chorionic villus sampling, CVS）

该技术是在B超的监视下，用特制的导管从阴道经宫颈进入子宫，再沿子宫壁到达预定的取样位置，并用内管吸取绒毛。多用于妊娠早期诊断，一般在妊娠7-12周时进行。由于绒毛组织含有大量的处于分裂期的细胞，获取的绒毛细胞可以直接用于染色体制备；但存在胎儿丢失风险较高、因绒毛组织镶嵌型存在导致假阳性或假阴性等缺点。

③脐带穿刺术（cordocentesis）

该技术在B超监视下，用一细针经腹壁进入胎儿脐带并抽取胎儿血样。一般在妊娠18周后至分娩前进行。优点是可用于妊娠中晚期胎儿遗传物质的检测，为已超过羊膜穿刺时间的孕妇赢得了产前诊断的机会，但是仍存在操作难度大、手术并发症较高等缺点。

③脐带穿刺术（cordocentesis）

又称羊膜腔镜或宫腔镜检查，是一种带有羊膜穿刺的双套管的光导纤维内窥镜，又细分为胚胎镜和胎儿镜，前者用于妊娠12周以前，镜子细小；在12周后应用的多为胎儿镜，孕中期胎儿镜的功能已由诊断转向宫内治疗领域。

2）非侵袭性方法

①母体外周血胎儿有核红细胞的发现与应用

存在于母血中的胎儿细胞包括滋养层细胞、胎儿淋巴细胞、胎儿有核红细胞等。胎儿有核红细胞是公认的较适合进行遗传诊断的胎儿细胞，其表面有多种胎儿特异性抗原标志物可供鉴别，且半衰期相对较短。但其存在相对稀少、分离富集的方法昂贵等缺点。

②母体外周血胎儿游离DNA/RNA的发现与应用

1997年，Lo等利用实时定量PCR的方法从孕妇血浆的总游离DNA中成功扩增出男性胎儿的Y染色体特异性序列（SRY基因序列），首次证实胎儿DNA可以进入母体外周血循环，并以游离DNA的形式稳定存在。具有含量高、孕早期可检测到、不受前次妊娠影响等特点。目前主要应用有胎儿Rh血型D抗原判断、胎儿性别鉴定、父系遗传的单基因遗传病、胎儿非整倍体染色体病、异常妊娠等。

3）胚胎植入前诊断（preimplantation genetic diagnosis, PGD）

在种植之前的早期胚胎中取出部分细胞检测疾病，从而筛选出正常的胚胎进行宫腔内移植，即胚胎植入前遗传学诊断。目前可开展PGD的遗传病主要有：单基因遗传病、三联体重复异常的疾病、染色体异常性疾病等。

文丨冯碧云

图 | Bing、百度

排版审核丨陈瑶

参考资料 | 《医学遗传学》人民卫生出版社 第三版

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