作者：李浩然，袁金峰，段淑娟，逄宇

第一作者及单位：李浩然和袁金峰，首都医科大学附属北京胸科医院/北京结核病与胸部肿瘤研究所细菌免疫室

通信作者及单位：逄宇，首都医科大学附属北京胸科医院/北京结核病与胸部肿瘤研究所细菌免疫室

Resistance and tolerance of Mycobacterium tuberculosis to antimicrobial agents—How M. tuberculosis can escape antibiotics

Li H, Yuan J, Duan S, Pang Y.

WIREs Mech Dis，2022，e1573.

doi: 10.1002/wsbm.1573.

PMID: 35753313.

研究背景

结核病自发现以来，对世界范围内的公众健康构成严重威胁。到目前为止，结核病仍是全球单一传染病死亡的十大原因之一。活动性肺结核的治疗主要依赖于多种抗结核药物。然而，在药物选择的压力下，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的不断进化促进了耐药菌株的出现，继而导致耐多药MTB的聚集，继发致命的耐多药结核病和广泛耐药结核病。MTB耐药机制的研究为临床治疗结核病、预防耐药提供了新的思路。MTB的耐药机制可概括为非特异性的固有耐药和获得性耐药，MTB的耐药性是通过单核苷酸的多态性、编码药物靶标的染色体基因重排以及细菌中的酶将前体药代谢成活性形式所产生的。MTB的突变也可以通过减少药物在细菌中的积累或使其失活而产生耐药性。本文对现有抗结核药物的耐药分子机制进行综述，以更好地了解MTB耐药性的演变，为更有效地对抗耐药结核病提供更有效的策略，加速实现2035年前终结结核病的战略目标。

MTB的药物耐受机制

MTB对环境的适应性决定了它们能否存活。研究表明，当药物作用于MTB时，转录将发生变化，导致抗药物耐受性的形成。在转录水平上，放线菌特异的WhiB转录因子和转录起始因子Sigma在调节耐药性方面发挥着作用。当转录时，MTB的毒素-抗毒素系统和siRNA的变化也会导致固有性耐药的产生。

在药物的压力下，某些MTB基因的表达会发生适应性变化，导致多种固有的耐药机制。如图1所示，除转录调控外，还包括其他药物耐受机制：（A）MTB通过代谢减少介导药物耐受；（B）MTB通过转化代谢介导药物耐受；（C）MTB通过增加药物外排泵介导药物耐受性；（D）MTB通过增厚细胞壁介导药物耐受性。

图1  MTB耐药机制。A：MTB通过代谢减少介导药物耐受；B：MTB通过转换代谢介导药物耐受；C：MTB通过增加药物外排泵介导药物耐受；D：MTB通过增厚细胞壁介导药物耐受。浅粉色背景代表药物耐受机制，浅灰色背景代表药物作用机制。ATP：三磷酸腺苷；TCA：三羧酸循环

然而，药物耐受的多种机制为导致耐药的突变积累提供了时间和机会。破译耐药MTB菌株的转录网络将增强我们治疗和干预活动性结核病的洞察力。

MTB对一线抗结核药物的耐药机制

1.利福平（rifampicin，RFP）：RFP主要通过干扰RNA聚合酶的转录功能来杀死MTB（图2）。研究表明，MTB可通过增加外排泵活性和代谢转化来产生RFP固有性耐药。RFP诱导的耐药性的发生通常与编码RNA聚合酶B的rpoB基因突变有关（图2）。几乎95%的rpoB基因突变集中在被称为利福平耐药性决定区的密码子区域，尤其是516、526和531密码子突变。

2.异烟肼（isoniazid，INH）：INH作为最有效的抗结核药物，自1952年以来一直被广泛应用于临床。在细菌中，INH主要由过氧化氢酶（katG）激活形成异烟酸，并与NAD+合成异烟酸NAD。异烟酰-NAD通过抑制Enoyl-ACP还原酶的活性来降低MTB细胞壁的完整性，而Enoyl-ACP还原酶是参与霉菌酸合成的关键酶，最终导致细菌分裂并死亡。此外，INH还可以减少活性氧（reactive oxygen species，ROS）诱导的坏死性免疫细胞死亡，并有效防止结核病的进一步发生（图2）。总体而言，通过产生替代途径绕过INH对细胞壁合成的影响来减少消耗和合成真菌酸是MTB产生INH耐药性的主要方式。

3.乙胺丁醇（ethambutol，EMB）：自1966年以来，EMB一直被用于治疗结核病，它能抑制MTB的生长，但不影响休眠的MTB，且常与INH和RFP联合使用。EMB为MTB细胞壁成分D-阿拉伯糖（decaprenylmonophosphoryl-D-arabinose，DPA）的类似物，通过抑制阿拉伯糖转移酶EmbC、EmbA、EmbB的活性和含量，使细胞壁合成成分不足，破坏其完整性，最终导致MTB死亡（图2）。研究表明，EMB诱导耐药的机制主要与MTB的embCAB基因突变有关，主要突变为embB（图2）。EMB耐药决定区位于embB基因上576bp的区域，由密码子306突变引起的EMB耐药在临床分离株中最为常见。此外，embC和embC-embA基因区的突变也与EMB耐药性有关。近年来，人们发现磷酸核糖转移酶UbiA与DPA的生物合成有关。当它发生突变时，会增加细胞内DPA的水平，并竞争性抑制EMB与embB结合，导致EMB耐药（图2）。ubiA突变导致DPA水平升高的机制可能是通过加速十烯基磷酸转化为DPA的前体—十碳烯基-磷酰基-β-D-5-磷酸核糖来实现的。此外，无论embB306如何突变，ubiA突变都会导致DPA合成增加，进而导致EMB的高水平耐药性。这为探索EMB耐药机制提供了新的方向。

4.吡嗪酰胺（pyrazinamide，PZA）：PZA作为前体药，可以杀灭巨噬细胞中的休眠菌。如图2所示，PZA可通过膜转运系统进入细胞，并在PZase（由pncA基因编码）的作用下转化为活性化合物吡嗪酸（pyrazinic acid，POA）。在体外，POA在酸性环境中转化为质子化的吡嗪酸，通过影响膜电位进入并杀死细菌。POA还可以抑制脱羧酶的活性，从而减轻CoA和泛酸的合成对关键代谢的抑制。此外，POA还可以直接靶向30S核糖体蛋白S1，影响蛋白质的翻译，这可能进一步增强PZA的活性。目前的研究表明，pncA基因突变可能是MTB对PZA耐药的主要机制（图2），但这种现象似乎具有地域差异性。一些研究还发现，rpsA和panD突变可能是pncA未突变的PZA耐药菌株的潜在检测指标。然而，这一类MTB菌株的数量很少，需要进一步研究才能找出这些位点突变的实际作用。

5.链霉素（streptomycin，STR）：STR作为最早的一线抗结核药物，仅杀灭处在对数生长期的MTB。如图2所示，STR可以直接与MTB核糖体30S亚基的16s rRNA和S12核糖体蛋白（由rpsL基因编码）结合，干扰核糖体的翻译和校对能力，并抑制蛋白质合成。研究表明，STR耐药性与rpsL、rrs和gidB基因突变有关。rpsL和rrs都参与蛋白质结构的形成，rpsL还参与维持rRNA结构的稳定。这两种突变都主要集中在rpsL的44和88密码子以及rrs的530和912密码子。

图2  MTB一线抗结核药物的耐药机制。A：一线抗结核药物的杀菌机制；B：一线抗结核药物的耐药机制。ATP：三磷酸腺苷；DP：十烯基磷酸；DPA：十烯基单磷-D-阿拉伯糖；DPPR：十烯基磷酰基-β-d-5-磷酸；EMB：乙胺丁醇；EMBA、B、C：阿拉伯聚糖转移酶A、B、C；H+：质子；HPOA：质子化的吡津酸；INH：异烟肼；INHA：烯醇酰载体蛋白还原酶；NAD+：烟酰胺腺二核苷酸；NADH：烟酰胺腺嘌呤核苷酸；POA-：化合物吡津酸；pRpp：5-磷酸核糖基1-焦磷酸；PZA：丙烯酰胺；RFP：利福平；ROS：活性氧基；STR：链霉素；TAG：三酰甘油；TCA：三羧酸循环

MTB对二线抗结核药物的耐药机制

1.氟喹诺酮类药物（fluoroquinolones，FQs）：FQs广泛应用于呼吸系统和泌尿系统感染，具有半衰期长、杀菌活性强等特点。莫西沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星和司帕沙星是目前用于抗结核治疗的FQs。FQs通过作用于MTB的DNA旋转酶（II型DNA拓扑异构酶）来抑制其复制和转录。MTB对FQs耐药的决定区位于gyrA和gyrB（图3），分别编码DNA旋转酶的A和B亚基。这些位点的连续累积突变导致了FQs耐药性的出现。研究表明，大多数FQs耐药发生在A亚基的决定区域，并常见于88、90、91或者94位点的突变。此外，当两种基因突变同时发生时，FQS的最低抑菌浓度（MIC）将进一步增加。

2.乙硫酰胺（ethionamide, ETH）、丙硫酰胺（prothionamide, PTH）：ETH和PTH的衍生物都是异烟酸，其抗结核机制与INH相似。它们都需要被前体药物激活酶EthA激活，与NAD+形成NAD复合体，然后抑制InhA的活性，影响MTB细胞壁的完整性（图3）。同样，ETH和PTH耐药的主要机制是参与前体药激活的ethA和inha发生突变。此外，ethR的过表达也增加了对ETH的耐药性（图3）。现有研究正通过开发新药，如Smart-420来抑制ethR的功能，从而促进ETH和PTH的杀菌活性。

3.对氨基水杨酸（para-amino salicylic acid，PAS）：PAS经常用于抗结核药物的组合中，以提高组合药物的整体疗效并降低其耐药性。PAS是对氨基苯甲酸（4-aminobenzoic acid，PABA）的结构类似物，能竞争性结合二氢叶酸合成酶（DHFS）并抑制二氢叶酸还原酶（DHFR）的活性，显著减少四氢叶酸（tetrahydrofolic acid，THF）的合成，从而显著减少脱氧尿苷5-磷酸到脱氧胸苷5-磷酸的转化，使得DNA合成障碍并导致MTB死亡。如图3所示，与PAS耐药性相关的基因包括胸苷酸合成酶（ThyA）、核黄素生物合成酶（RibD）和二氢叶酸合成酶（FolC）。ThyA催化途径是脱氧尿嘧啶核苷酸（dUMP）合成脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）的主要方式。当thyA基因突变时，dTMP的合成可以被不消耗THF的ThyX途径所取代，然后THF不断积累，导致PAS耐药。RibD可以催化二氢叶酸（DHF）还原为THF，因此RibD的表达上调了DHFR可代偿部分的能力，导致PAS耐药。folC基因的突变可以阻止PAS被DHFS激活，从而导致PAS耐药。此外，目前的研究发现，酰基转移酶PapA1及sigB和mmpL11等基因的突变也与PAS的耐药性有关。

4.氯法齐明（clofazimine，Cfz）：Cfz主要用于治疗麻风病，近年来已被用于治疗结核病。Cfz的作用机制尚不清楚，可能与超氧化物、过氧化氢或ROS的产生有关。另一种可能的耐药机制是通过抑制细菌对钾的吸收来减少ATP的产生。研究表明，rv0678（转录调控因子）的突变是Cfz耐药的主要机制，它可以上调外排泵MmpL5，导致Cfz和贝达喹啉（Bdq）之间的交叉耐药。最近的研究表明，Rv1979c和Rv2535c也与Cfz耐药有关，但还需要更多的研究来证明这一点。

5.D-环丝氨酸（D-cycloserine，DCS）：DCS和RFP一样，属于广谱抗生素。DCS为D-丙氨酸的结构类似物，主要影响MTB细胞壁中D-丙氨酸合成肽聚糖。它通过抑制ddlA编码的丙氨酸消旋酶和丙氨酸连接酶影响细胞壁的形成，达到抗菌目的（图3）。目前已发现MTB耐药株的基因突变位点主要集中在ald、pncA和ddlA（图3）。ald基因编码L-丙氨酸脱氢酶，参与丙氨酸代谢。研究发现，ald基因的缺失会增加MTB的L-丙氨酸补偿，大量L-丙氨酸的积累会降低DCS的竞争抑制，导致耐药性。由pncA基因编码的Alr在丙氨酸代谢途径中将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸。ddlA基因编码的丙氨酸连接酶，催化两个D-丙氨酸分子合成Ddl，参与丙氨酸代谢。Alr和Ddl的过度表达可导致卡介苗和耻垢分枝杆菌对DCS产生耐药性。

6.卡那霉素、卷曲霉素、阿米卡星、万古霉素：氨基糖苷类药物（卡那霉素、阿米卡星、维霉素类）和多肽类药物（卷曲霉素）为抗结核二线注射用药。与STR一线注射用药一致，这些药物通过与30S核糖体亚基中的16s rRNA结合来抑制MTB蛋白的合成（图3）。同样，这4种药物的耐药性也与rrs基因突变有关（图3）。最近的研究表明，eis基因或whiB7基因突变可导致某些MTB对卡那霉素产生耐药性。研究表明，阿米卡星的低水平耐药还与eis基因启动子区的突变有关。此外，编码rRNA甲基转移酶的tylA基因突变也会导致MTB对卷曲霉素和紫霉素的抗药性。

7.利奈唑胺（linezolid，Lzd）：作为恶唑烷酮，Lzd可通过与50s核糖体结合抑制核糖体70s亚基启动子复合物的形成和蛋白质合成，从而发挥其抗MTB作用（图3）。大多数已知的Lzd耐药相关MTB基因突变发生在rplC和23s rRNA中，rplC（T460C）突变是最常见的（图3）。不同程度的Lzd抗性可能与编码MTB 50s核糖体蛋白L3的rplC基因表达水平和突变后氨基酸空间结构的变化有关。23s rRNA基因，也称为rrl基因，参与MTB的50s核糖体形成。多种23s rRNA基因突变可导致Lzd抗性，其中G2061T是最常见的突变类型，并且表现出更高程度的Lzd抗性。

图3  MTB二线抗结核药物耐药机制。A：二线抗结核药物的杀菌机制。B：二线抗结核药物的耐药机制。ALR：丙氨酸消旋酶；AMK：阿米卡星；ATP：三磷酸腺苷；CAP：卷曲霉素；CFZ：氯法齐明；DCS：D-环丝氨酸；Ddl：丙氨酸连接酶；DHF：二氢叶酸；DHFR：二氢叶酸还原酶；DHFS：二氢叶酸合成酶；DTMP：脱氧胸苷5-磷酸；DUMP：脱氧尿苷5-磷酸；ETH：乙硫酰胺；FQ：氟喹诺酮；H2O2：过氧化氢；inha：烯醇酰基载体蛋白还原酶；Kan：卡那霉素；LZD：利奈唑胺；NAD：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；PABA：对氨基苯甲酸；PAS：对氨基水杨酸；PTH：丙硫酰胺；ROS：活性氧；THF：四氢叶酸；Vim：紫霉素

抗结核新物的耐药机制

1.贝达喹啉（bedaquiline，Bdq）：Bdq为二芳基喹啉，可以特异性抑制ATP合成酶，使得ADP不能转化为ATP，导致MTVB中ATP的消耗（图4a）。然而，已经发现MTB具有丰富的Bdq固有药物抗性机制，包括过度表达一些转录因子，减少TCA循环以减少ATP消耗并改变代谢途径以维持ATP水平等。MTB中atpE基因密码子63位点的突变抑制了Bdq结合ATP合酶C亚基的能力，导致Bdq抗性（图4a）。此外，编码MmpL5负调控因子的mmpR和pepQ基因突变，可导致Bdq和Cfz之间的交叉耐药。

2.德拉马尼（delamanid，Dlm）、PA-824：硝基咪唑抗结核药物Dlm和PA-824都属于前体药，需要依赖于F420辅因子的硝基还原酶（nitroxanthin dependent nitroreductase，Ddn）激活以破坏细胞壁的合成。Dlm和PA-824对休眠状态和胞内的MTB都有杀菌作用（图4b）。当PA-824被Ddn激活时，会产生不稳定的亚硝酸，随后形成NO，抑制MTB呼吸链的电子传递，从而抑制MTB的生长。Ddn的活性决定了Dlm和PA-824的杀菌效果，其产生取决于F420依赖的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶介导的还原辅酶F420（F420H2）和辅酶F420之间的氧化还原循环。F420的合成依赖于F420依赖的葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因编码的一组酶，它进一步合成并重新激活fbiA、fbiB和fbiC。因此，这5种酶的任何异常都会导致MTB中Dlm和PA-824的耐药水平较高。一直无法解释未发生上述5种突变情况的Dlm和PA-824菌株是如何产生耐药性的，直到最近的研究证实这些耐药株存在fibD基因突变。FibD是一种最近被证实的鸟苷单磷酸转移酶，是合成F420所必需的。此外，活化的PA-824还可以将霉酚酸酯的羟基氧化为羰基，从而影响细胞壁中分枝菌酸的合成，形成有氧杀菌机制。

3.SQ-109：作为EMB的衍生物，SQ-109也参与合成MTB的细胞壁。SQ-109通过影响海藻糖单菌酸盐的积累，使海藻糖二霉菌酸酯无法合成，并抑制麦考酚酯与阿拉伯半乳聚糖的附着，从而抑制MTB细胞壁的合成（图4b）。

图4  抗MTB新药耐药机制。A：贝达喹啉的杀菌和耐药性机制。B：德拉马尼和PA-824的杀菌和抗药性机制。C：SQ-109的杀菌和抗药性机制。浅灰色背景代表杀菌机制，浅粉色背景代表耐药机制。ADP：二磷酸腺苷；ATP：三磷酸腺苷；DDN：依赖脱氮黄素（F420辅因子）的硝基还原酶；F420：辅酶；F420H2：还原辅酶F420；FbiA、B、C：F420生物合成蛋白；Fgd1：F420依赖的葡萄糖6-磷酸脱氢酶；TDM：海藻糖二霉菌酸酯；TMM：海藻糖单菌酸盐

展     望

综上所述，我们提出了使MTB能够耐受抗微生物治疗的一般耐受和耐药机制。尽管在阐明抗菌素耐药性的分子基础方面取得了实质性进展，但对于非一线抗结核药物的耐药性机制仍有进一步阐明的余地。MTB耐药突变的综合分析有望成为优化结核病治疗策略和改善临床预后的有价值的工具。

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供稿：逄    宇

编辑：孟    莉

审校：范永德

发布日期：2022-07-15