CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)系统是目前被广泛使用的第三代基因组编辑系统[1]。该系统是具有核酸酶活性Cas9蛋白在向导RNA (sgRNA)的引导下在靶点基因处进行切割，从而产生DNA双链断裂(double strand break, DSB)，断裂后的基因组利用同源重组(homologous recombination, HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)实现对基因组DNA进行编辑[2]。其中由于DSB具有细胞毒性、HR途径必须人为提供供体DNA且依赖于细胞周期、NHEJ的修复精确度低并会产生插入和缺失(indels)[2-4]，因此单纯依靠CRISPR/Cas系统较难实现高效且稳定的基因编辑。

碱基编辑系统(base editing)是在CRISPR/Cas系统的基础上进一步衍生出的一种新型基因修饰技术，依据融合的碱基修饰酶种类不同可以分为胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editors, CBE)以及腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editors, ABE)[5]。其原理为将失活的dCas9 (deactivated Cas9)或只有单链切割活性的nCas9 (nickase Cas)与能够作用于ssDNA (single-stranded DNA)的嘧啶或嘌呤脱氨酶融合，精准实现靶位点的碱基编辑。由于编辑过程中不依赖于DBS的产生、不需要供体DNA的参与、不依赖于细胞周期和产物纯度高等优点，碱基编辑系统可以实现较为高效且精准的基因编辑，目前已成功应用于各类动物、植物、人类胚胎和细菌等[4]。

碱基编辑器CBE和ABE只能实现将C·G碱基对替换为T·A碱基对(C-T)，或者将A·T替换为G·C (A-G)。除此之外，研究人员在CBE的基础上开发了能够将胞嘧啶转换为鸟嘌呤的新型碱基编辑器(C-to-G base editor, CGBE)[6]。工作原理是首先将C转换成U，其次是尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil DNA N-glycosylase, UNG)将U切除后，通过碱基切除修复机制引入效应诱导靶向C-G碱基转换，还有C-T和C-A转换[7]。当然最终的目的是实现高效、高纯度的C-G碱基编辑，于是David R. Liu团队通过CRISPR筛选、靶点数据库分析并联合机器学习开发了更有应用前景的CGBE[8]。随后左二伟团队也利用深度学习模型开发能够准确预测目标位点的OPTI-CGBEs[9]。

CBE系统由nCas9或dCas9与胞嘧啶脱氨酶组成[5, 10]。工作原理是在sgRNA引导下靶向目标DNA，并与基因组DNA和Cas9蛋白形成R-loop复合体，Cas9蛋白使DNA局部解链，使得胞嘧啶脱氨酶可以与R-loop复合体中未与sgRNA配对的ssDNA结合，将ssDNA上一定区域的胞嘧啶(C)脱氨变成尿嘧啶(U)，继而通过DNA修复或者复制机制使尿嘧啶(U)被胸腺嘧啶(T)替换，最终实现完成C到T或G到A的替换[10] (图 1)。

研究者通过不断地对CBE系统各个元件的改造升级，并基于此开创性地研发了4代碱基编辑器(BE1-BE4)，同时基于CBE系统的限制又对各代碱基编辑器不断地作出优化改造[10]。2016年，刘如谦团队率先开发第一代碱基编辑器(base editors1, BE1)，该系统由具有脱氨酶活性最高的大鼠APOBEC1、连接蛋白(XTEN)和完全失去切割活性的dCas9组成。编辑活性窗口为距离前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)序列最远端开始数起的第4−8位，体外编辑效率可达25%−40%，但在哺乳动物细胞内编辑效率却大幅下降至0.8%−7.7%。这主要是因为尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil DNA glycosylase, UDG)可以识别U·G错配，并通过碱基错配修复途径逆转由BE1产生的U·G中间产物返回到C·G碱基对。于是，催生了第二代碱基编辑器(BE2)的开发，即只在原来的基础上引入了UDG抑制剂(uracil DNA glycosylase inhibitor, UGI)，UGI通过抑制UDG作用将原来编辑效率提高3倍。随后，该团队通过将单链切口酶活性的nCas9替换dCas9生成了第三代碱基编辑器(BE3)，该系统通过碱基错配修复将碱基编辑效率提高至37%左右，其编辑活性窗口仍为第4–8位。缺点是编辑产物的纯度较低，具体机制是UDG可以切除靶基因上的碱基U形成无嘌呤或者无嘧啶位点(apurinic or apyrimidinic site, AP)，被AP裂解酶识别后编辑链会被切开，加上非编辑链也被nCas9切开，从而导致DBS的形成，进而引发NHEJ随机修复[11]。为了解决上述问题，第四代碱基编辑器(BE4)在BE3的基础上应运而生，通过再融合一个UGI提高对UDG的抑制作用，使得编辑效率大大提高，并且非目标编辑产物的出现频率大约也降低了一半[12]。

在上述四代碱基编辑器的基础上，科研人员为了提高编辑的限制继而开发出了一系列改良版本的CBE系统。高彩霞团队发现，BE3会在水稻中诱导全基因组发生无法预测的脱靶突变[13]，Zuo等也在小鼠胚胎中证实了BE3会诱导基因组发生大量脱靶突变的这一特性[14]。研究表明，这种脱靶事件与Cas9依赖性脱靶编辑和非Cas9依赖性脱氨基作用相关[15]。因此，可通过使用有更高DNA特异性的Cas9变体以及rAPOBEC1突变体，来减少脱靶事件的发生。针对Cas9依赖性脱靶突变，刘如谦团队将BE3与一种高保真SpCas9变体(HF-Cas9)结合构建了HF-BE3，将BE3的脱靶水平降低了37倍，并使用核糖核蛋白复合物(ribonucleoprotein, RNP)代替质粒递送碱基编辑器系统，有效降低了脱靶事件的概率[16]，但高彩霞团队发现其在水稻中仍会诱导基因组发生无法预测的脱靶突变[13]。针对非Cas9依赖性脱氨作用，Grünewald团队通过引入破坏rAPOBEC1α-螺旋的两种突变，构建了BE3-R33A和BE3-R33A/K34A，与野生型CBE相比，在目标位点上实现了更为精准的DNA编辑[17]。刘如谦团队通过运用细菌耐药性测定、细菌胸苷激酶毒性试验和体外动力学测定等多种方法发现，在能够保留与BE4类似编辑效率的前提下，带有YE1脱氨酶结构域的CBE系统大幅降低了依赖于Cas9和非依赖于Cas的脱靶事件的发生，实现目标位点的高保真碱基编辑[15]。杨贝团队通过融合可切割的脱氧胞嘧啶脱氨酶抑制剂(deoxycytidine deaminase inhibitor, dCDI)结构域，构建了transformer BE (tBE)系统，可在仅有背景水平的脱靶突变下实现高效碱基编辑[18]。

针对编辑产物的纯度问题，通过将Gam与编辑系统结合，开发的CBE4-Gam可以有效降低indels的产生[12]。对于提高编辑效率的问题，通过核定位信号(nuclear localization signal, NLS)修饰、密码子优化以及脱氨酶改造，进一步优化了CBE4，构建了编辑效率更高的BE4max和AncBE4max[19]。然而，由于APOBEC1对底物靶点上下游序列有偏好性，富含GC的序列脱氨基并不理想[10, 20]。因此刘如谦团队开发了使用噬菌体辅助连续进化碱基编辑器(phage-assisted continuous evolution of base editors, BE-PACE)技术，用于改进的脱氨酶[21]。结果表明，CBE进化后产生的evoAPOBEC1-BE4max，在富含GC的序列中编辑胞嘧啶的效率比野生型APOBEC1高26倍，同时能在其他所有的序列维持高效编辑。李亦学团队通过突变rAPOBEC1上负责活性位点疏水性的位点(p.W90Y)、引入p.R126E突变以及进一步优化核定位信号构建了YE1-BE3-FNLS。该编辑器不仅保留有与BE4max相当甚至高于BE4max的编辑效率，同时造成的非目标编辑与indels的水平更低[22]。Lukas E Dow团队通过NLS修饰以及nCas9密码子优化重新设计了BE3、BE4Gam和xBE3的序列，优化后的编辑系统碱基编辑范围(2X-BE3)扩大，编辑效率也提高为BE3的15倍(FNLS-BE3)[23]。李大力团队基于nCas9和脱氨酶之间插入一个Rad51单链DNA结合蛋白的功能域开发了一系列超高活性CBE (hyCBE)。编辑窗口由4−9拓展为4−15，活性最高提高了257倍[24]。

面对碱基编辑活性窗口的问题，可根据研究目的选择不同类型的CBE。David R. Liu团队通过突变rAPOBEC1与DNA互作的关键酶活位点，构建了YE1-BE3、YE2-BE3、EE-BE3以及YEE-BE3系统，虽然编辑效率有所降低，但成功将编辑窗口由第4−8位缩小至第4位或第4–5位[25]。此外，其中的YEE-BE3系统也有助于减少脱靶突变[13]。黄行许实验室利用SunTag系统研发出了BE-PLUS，在BE3的基础上将编辑窗口由第4−8位扩大至第4−16位[26]。

ABE系统由人工改造的腺嘌呤脱氨酶和nCas9构成[27]，工作原理类似于CBE系统，即在sgRNA的作用下，与Cas9N相连接的脱氨酶可将靶点DNA上一定区域的腺嘌呤脱氨(A)转化为腺苷(I)，而在DNA上的I会被当作鸟嘌呤(G)识别，进而使得非编码链上与A配对的T变为C，最终完成A到G或T到C的替换(图 2)。

ABE系统发展缓慢的原因在于目前发现的自然界存在的腺嘌呤脱氨酶都不能以DNA为底物[27]。David R. Liu研发团队[27]选用大肠杆菌TadA经过定向进化和改造，筛选出了能够作用于ssDNA的腺嘌呤脱氨酶ecTadA (Escherichia coli TadA)的突变体ecTadA*，虽然在大肠杆菌中可以进行A-I转换，但在哺乳动物细胞上表现出的编辑效率不高。为了进一步提高编辑效率，在脱氨酶改造的过程中将野生型ecTadA单体与定向进化出的ecTadA*单体融合形成单链异二聚体，该异二聚体与nCas9结合形成了ecTadA-ecTadA*-nCas9融合蛋白，之后经过7轮的进化与改造后，筛选出编辑效率最高且应用最广的ABE系统ABE7.10，其编辑效率可达53%，编辑窗口为距离PAM序列最远端开始数起的第4−7位[27]。虽然ABE系统有着碱基替换的高精确度，且indels的发生频率较低，但其仍存在编辑效率低下、编辑范围、脱靶和编辑窗口的限制性等问题[4]。在提高编辑效率方面，David R. Liu团队通过密码子序列优化以及增加NLS个数优化了ABE7.10，成功构建了ABEmax，有效提高了碱基编辑效率[19]。高彩霞团队通过密码子优化、异二聚体和NLS位置的调整以及NLS数目的增加等方式优化出的PABE-7系统，相较于ABE7.10在小麦和水稻中的编辑效率提高了1倍以上[23]。Nicole M. Gaudelli团队和David R. Li等[28]通过在ABE7.10的TadA中引入额外的突变，构建了ABE8s和ABE8e。其中ABE8s在非NGG的PAM序列中编辑效率比ABE7.10高约4.2倍，在NGG的PAM序列中A5–A7位点的编辑效率高约1.5倍，在A3–A4和A8–A10位点的编辑效率高约3.2倍，不仅编辑效率得到了提高，编辑范围也有所扩大[28]。而ABE8e有效提高了ABE与Cas同源物的兼容性，显著增加了ABE在与多种Cas同源物配对时的碱基编辑效率[29]。随后研究人员在ABE8e基础上生成新的变体ABE9e表现出更高和更精确的碱基编辑活性[30]。此外，Fu等通过对脱氨酶成分改造生成3种高活性ABE变体，其中NG-ABEmax-KR (N127K/Q154R)变体在人类细胞和小鼠疾病模型中表现出较高的编辑效率[31]。在扩大编辑范围方面，David R. Liu团队通过使用可与非NGG序列PAM相容的SpCas9变体，创建了VRQR-ABEmax、VRER-ABEmax、SaABEmax以及SaKKH-ABEmax等，成功在哺乳动物细胞上扩大了碱基编辑范围[32]。此外，该团队通过使用循环排列的Cas9变体，在保证编辑效率与ABEmax相同的条件下，将编辑窗口由4−5个核苷酸(nt)扩展为8–9 nt[32]。面对脱靶的问题，研究人员设计了脱氨酶TadA 7.10中突变(eTadA-K20A/R21A或eTadA-V82G)生成高保真碱基编辑器，从而大大减小了脱靶效率[33]。此外，通过合并wtTadA-F148A和eTadA-F148A来改进ABE7.10，同样大大减小了脱靶效率[34]。

现有的碱基编辑器仅能单独诱导单一类型的修饰，而李大力团队[35]和J. Keith Joung[36]团队通过将胞嘧啶脱氨酶、腺嘧啶脱氨酶与Cas9切口酶融合，分别创建了A & C-BEmax和SPACE (synchronous programmable adenine and cytosine editor)，在同一靶点上能够同时实现C至T和A至G的转换，扩大了碱基编辑的应用范围。

在家畜育种中选择性状主要体现在家畜生产性状改良，包括生长性状、肉质和奶品质；家畜繁殖性能改良，包括排卵数和产羔数等；家畜经济性状改良，包括羊毛产量和品质；家畜抗病性能改良，包括抗病毒、细菌及寄生虫等；家畜动物模型制备，包括人类疾病模型或制备药品等；家畜异体器官移植方面的应用等[37]。在家畜育种中利用全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)、全基因组重测序、转录组测序和蛋白组技术等技术挖掘与鉴定了一批家畜上与生产、经济、繁殖和抗病等性状相关的功能基因。其次利用多组学测序(三维基因组(Hi-C)、ATAC-Seq、ChIP-Seq、单细胞测序和空间转录组测序)和单碱基基因编辑技术对上述重要性状主效基因的功能鉴定、重要性状的遗传及表观遗传调控网络解析和重要性状的功能基因组学研究。

肌肉生长抑制素(myostatin, MSTN)是肌肉生长发育的负调控因子，参与抑制肌细胞的增殖与分化。MSTN突变显著增加肌肉纤维的直径和肌纤维数量[38]。姚旭东利用AncBE4max系统在哈萨克羊MSTN基因中提前引入终止密码子，其中在细胞中sg1和sg2靶位点编辑效率分别为26.7%和6.7%。而sg1在孤雌胚和受精胚中编辑效率分别为70%和90%。随后将28枚MSTN基因编辑胚胎移植到9个受体母羊中，其中6只妊娠母羊，最终获得8只羔羊，5只健康羔羊，3只死亡。8只羔羊均发生预期的碱基转换，编辑效率为100%[39]。除此之外，Pan等利用改造的YE1-BE4maxNG对巴马猪成纤维细胞MSTN基因中提前引入终止密码子，结果发现sg1-sg5编辑效率分别是10.3%、1.0%、10.5%、28.7%和29.8%[40]。Wang等通过新改造hA3A-BE3-NG载体在猪胎儿成纤维细胞中对MSTN基因进行单碱基编辑，靶位点编辑效率是46.3%[41]。

王煜等利用碱基编辑器在巴马猪胎儿成纤维细胞中对胰岛素样生长因子2 (insulin-like growth factor 2, IGF2)进行高效、精确的定点编辑。结果表明，hA3A-BE3的编辑效率可以达到71.43%，但有42.86%的细胞存在插入和缺失(indels)；hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F的编辑效率分别是56.86%和40.38%，indels的效率分别是31.37%和21.15%[42]。SOCS2基因的突变也会使个体产生体重增加/体型增大的表型。陈玉林团队利用BE3系统对绵羊上SOCS2基因进行碱基编辑，通过原核注射共出生3只阳性后代，突变效率为25%左右，基因编辑后代羊在体型、体重和产奶量等生产性状上明显高于野生型羊[43](表 1)。

繁殖性状作为绵羊重要的经济性状。骨形态发生蛋白受体1B (BMPR1B, FecB)、骨形态发生蛋白15 (BMP15, FecX)和生长分化因子9 (GDF9, FecG)作为绵羊多羔性状候选主效基因，在调控绵羊产羔性状方面起到至关重要的作用。丁一格利用腺嘌呤碱基编辑器对滩羊成纤维细胞上FecB基因进行单碱基定点编辑。结果显示，在细胞层面ABE7.10、ABEmax和xCas9-ABE的编辑效率分别为18.75%、53.85%及38.46%。在胚胎上编辑效率为22.91%。同时胚胎移植到18个受体母羊中，获得6只妊娠母羊，最终获得8只基因编辑羔羊。其中6只羔羊产生了预期的碱基替换[44]。之后通过扩繁获得FecB基因编辑羊，51只FecB基因突变母羊中36只母羊妊娠，产羔54只，产羔母羊百分率为70.59%，产羔率为150.00%。相比野生型，FecB基因突变产羔率提高43.86%[45](表 1)。

FGF5基因与毛囊生长发育相关，该基因敲除后可以使山羊绒毛生长速度加快，产绒量大幅度提高。李冠纬使用BE3在陕北白绒山羊的FGF5基因的第一外显子区域提前引入终止密码子。结果发现4个sgRNA细胞水平的编辑效率在10%−34%之间。其中7只受体母羊，受孕3只，最终获得5只羔羊。5只羔羊的FGF5基因均发生了编辑，编辑效率为100%，阳性后代毛纤维显著长于野生型山羊，毛囊也显著多于野生型山羊[46]。孙嘉媛等选定陕北白绒山羊的FGF5基因，利用xCas9-BE4、BE3和BE4max三种新型单碱基编辑器，在成纤维细胞上BE4max的编辑效率为92.86%，比普通编辑器BE3高56.5%，但xCas9-BE4未产生编辑[47]。周平团队利用BE4max对绵羊成纤维细胞和胚胎中FGF5基因第1外显子引入终止密码子，结果发现sgRNA-T1和sgRNA-T4的编辑效率分别为68.75%和47.37%。sgRNA-T4孤雌激活胚胎中编辑效率为80%[48](表 1)。

在家畜抗病育种中，通过基因编辑技术敲除或敲入抗病基因可快速培育抗病品种，降低疾病引起的经济损失。Wang等通过新改造hA3A-BE3-NG载体，对具有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗性的CD163基因和猪传染性胃肠炎病毒(TGEVs)抗性的APN基因在猪胎儿成纤维细胞进行单碱基编辑，靶位点编辑效率分别是33.33%和35.19%[41]。同时Pan等利用改造的YE1-BE4maxNG对巴马猪成纤维细胞CD163基因靶位点编辑效率为6.5%[40]。此外，赵建国团队通过在细胞和胚胎层面筛选出影响最小的碱基编辑器hA3A-BE3-Y130，结合显微注射的方法生产一个MSTN、CD163和IGF2三基因突变猪。结果发现猪的CD163和MSTN基因不表达，IGF2表达增加，显著提高猪的生长性能和抗病能力(表 1)。

研究人员通过将BE3系统与体细胞核移植技术结合，对猪的TWIST2和TYR基因进行单碱基编辑，成功建立了无脸巨口综合征和皮肤白化病的大动物疾病模型[19]。张婷婷等采用BE3和ABE7.10对猪PK15细胞的CMAH、MC1R(1-2)和MC1R(2-1)基因编辑窗口内C-T的效率分别为2.2%、0.4%和1.3%，猪GGTA、MSTN-2窗口内A-G的效率分别为1.4%和1.4%[49]。赖良学课题组利用BE3和A3A-BE3在猪的细胞和胚胎层面，对基因组进行三基因单碱基编辑。在胚胎上，三基因同时被编辑效率最高可达50%。而在细胞层面上，三基因同时被编辑效率最高可达25%。并且通过体细胞核移植和胚胎注射两种途径获得两种单位点单碱基突变猪模型(杜氏肌营养不良症和早衰症猪模型)和一种三位点单碱基突变猪模型(重症免疫缺陷猪模型)[50](表 1)。

猪作为人类器官移植最理想的异种器官移植供体。pol基因作为猪与人异种器官移植安全性的关键基因之一，赖良学课题组利用BE3在pol基因中提前引入终止密码子，结果发现最高可减少84.9%的PERV拷贝数[50]。此外，袁泓明使用BE4-Gam和AncBE4max系统对猪GGTA、CMAH和B4GalNT2进行单碱基编辑。结果表明BE4-Gam系统在猪胎儿成纤维细胞和孤雌囊胚中GGTA1、B4GalNT2和CMAH基因目的位点分别可实现5.3%−10.1%和66.7%−71.4%的单基因编辑效率；在猪胎儿成纤维细胞和孤雌囊胚GGTA1、B4GalNT2和CMAH基因目的位点分别可实现7.5%和18.1%的多基因编辑效率。同时发现AncBE4max系统在猪孤雌囊胚及成纤维细胞的目的基因位点可以提升近5倍的单基因编辑效率，在胚胎水平上可实现71.4%的多基因编辑效率。之后通过胚胎移植技术获得了1头GGTA1和2头B4galNT2嵌合突变的F0代大白猪。最后通过体细胞核移植技术，获得了1头三基因突变(GGTA1基因杂合突变、B4galNT2纯合突变及CMAH基因杂合突变)的F0代巴马香猪[51] (表 1)。

牛的早期胚胎发育涉及一系列基因的调控，如SMAD4、TEAD4和CDX2等。张坤团队通过显微注射的方法利用BE3和ABE7.10在牛胚胎中对SMAD4进行基因编辑，结果发现BE3在靶位点6和7位的平均效率分别为86.3%和85.4%。ABE7.10在靶位点第5位的平均效率为79.4%。同时靶向二代测序的结果表明在靶位点附近有脱靶现象存在，但在6个预测的潜在脱靶位点中均未发现明显的脱靶现象。BE3和ABE7.10对牛胚胎中SMAD4、CDX2和TEAD4三基因同时编辑的效果分别是25.8%和23.3%，但胚胎存在镶嵌。同时利用BE3在牛胚胎中的CDX2基因中提前引入终止密码子，结果发现BE3能够在牛胚胎中进行高效率的基因敲除[52](表 1)。

虽然应用最广泛的基因编辑技术CRISPR/Cas9拥有众多优点，但是在单个碱基水平的编辑时其效率很低。与CRISPR/Cas9系统DBS具有细胞毒性、HR途径必须人为提供供体DNA且依赖于细胞周期和NHEJ的修复精确度低并会产生插入和缺失相比，碱基编辑具有不依赖于DBS的产生、不需要供体DNA的参与、不依赖于细胞周期和产物纯度高等优点，碱基编辑系统可以实现较为高效且精准的基因编辑，因此，碱基编辑器能够在动物品种改良、畜牧业生产、动物模型构建和疾病治疗等方面发挥强大的作用。碱基编辑系统自2016年首次开发至今，已经成功应用于多个研究领域，但在家畜上开展的研究还相对较少[5, 53-55]。我们团队近期建立了藏绵羊MSTN、FecB、GDF9和BMP15单碱基编辑体系，为后续培育多胎以及双肌藏绵羊提供了基础。

时至今日，面对碱基编辑器发展中遇到的各种问题，科研工作者从降低编辑产物纯度、序列背景依赖性、提高编辑效率、扩大或缩小编辑范围、碱基编辑活性窗口和脱靶效应等问题不断改进和优化碱基编辑器[56-60]。因此想要进一步开发碱基编辑器工具在家畜育种中的应用必须对其作更多的改进。我们实验室前期研究中，ABEmax和BE4max在对绵羊成纤维细胞中FecB、GDF9和BMP15基因进行单碱基编辑时，发现目的位点附近并没有合适的PAM序列，细胞编辑效率低下、碱基编辑活性窗口内非靶点编辑和indels发生率高等问题。因此笔者希望在今后的研究中对碱基编辑器进行改造以达到在动物育种中发挥强大作用的目的。碱基编辑系统改造主要有4个方面：(1) PAM位点的限制。由于碱基编辑技术依赖于Cas9蛋白对单个碱基进行编辑，对靶点的选择十分依赖于PAM位点。虽然SpCas9、xCas9和SpCas9-NG等非NGG PAM的Cas9变体的开发大大扩宽了碱基编辑的应用范围，但仍不能做到对任意位点的覆盖[25, 61-63]。(2) 编辑效率低下。可以通过以下几个手段提高编辑效率：在nCas9和脱氨酶之间插入一个Rad51单链DNA结合蛋白[15]，小巧的Cas12a蛋白取代了传统的Cas9蛋白减少载体大小[62, 64-65]，小分子抑制剂和胞嘧啶脱氨酶做家畜的密码子优化等[66-68]。(3) 碱基编辑活性窗口内非靶点编辑。依据不同的研究目的需要对编辑活性窗口做相应的改变。如何进一步缩小突变窗口，真正做到只改变单一碱基而不影响旁侧序列，将是碱基编辑系统今后重点攻克的方向[25, 69-70]。(4) indels发生率高。产物特异性不佳，CBE系统有时会出现碱基编辑产物不纯的现象，即会有C到非T产物的出现，还会有碱基的随机插入和缺失，即出现脱靶现象[12, 16, 71]。

综上所述，碱基编辑技术在家畜育种领域有着巨大潜力，但由于家畜中，通过显微注射和核移植技术获得基因编辑后代存在概率小、难度大和周期长等问题，因此会在PAM位点的限制、编辑效率、精确度及脱靶效应等方面导致碱基编辑技术在家畜育种领域中仍然受到一些限制。尽管目前碱基编辑技术做出了一定程度的改良，但还有许多不完善之处，因此开发精准碱基编辑将会为家畜育种提供强有力的技术工具。