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(共51张PPT)第2节 微生物的培养技术及应用01微生物的基本培养技术WEISHENGWUDEJIBENPEIYANGJISHU02微生物的选择培养和计数WEISHENGWUDEXUANZEPEIYANGHEJISHU教学目标1. 概述培养基的配制方法和微生物纯培养的基本操作要求,进行酵母菌的纯培养。2. 阐明微生物选择培养的原理。3. 进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢？本节聚焦1.怎样运用生物与环境相适应的观点来解释选择培养的原理？2.如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微生物？3.测定微生物数量的常用方法有哪些？1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌( Thermus aquaticus)，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)。这是因为水生栖热菌能在 70~80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。讨论1.为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？2.以上例子给我们在分离纯化微生物带来什么启示？实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等) ，同时抑制或阻止其他微生物的生长。在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。（一）选择培养基1. 定义类型 条件 分离得到的菌种（1）改变培养条件（2）添加某种化学物质（3）营养缺陷70～80℃的高温水生栖热菌2.类型加入青霉素酵母菌、霉菌等真菌高浓度食盐金黄色葡萄球菌不加碳源不加氮源自养型微生物固氮菌培养基中加氨苄青霉素没有氨苄青霉素抗性的细菌具有氨苄青霉素抗性的菌落培养基应有菌落没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰怎样选择出抗氨苄（biàn）青霉素能力的细菌 （一）选择培养基选择培养基配方的设计尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可以作为细菌生长的氮源。讨论：1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来。这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据是_________________________________；该类培养基的主要用途为_____________________；2.从用途上来讲，培养基二属于______培养基，目的是为了获得_____________________；3.两种培养基共有的培养基成分有：________________________；培养基一的碳源为________，氮源为________；培养基二的碳源为________，氮源为________。培养基一牛肉膏 5.0g蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g琼脂 20.0g蒸馏水 定容到1000ml培养基二KH2PO4 1.4gNaH2PO4 2.1gMgSO4·7H2O 0.2g葡萄糖 10.0g尿素CO(NH2)2 1.0g琼脂 15.0g蒸馏水 定容到1000ml固体添加了凝固剂琼脂，且比例为1.5%~2%分离、鉴定、计数选择能分解尿素的微生物碳源、氮源、无机盐、水牛肉膏蛋白胨葡萄糖尿素由以上分析，可以知道如何分离土壤中能分解尿素的细菌，然而，能否估算出 1 g 土壤中的有多少分解尿素的细菌呢？要如何解决？不能，还需要对土壤进行适当的处理以及科学的测定微生物数量的方法。由于土壤中细菌的数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布在制备好的选择培养基上，也就是要采用稀释涂布平板法。（二）微生物的选择培养1.方法应采用稀释涂布平板法。2.方法概述由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯培养物，必须要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。两个基本操作：梯度稀释和涂布平板。1ⅹ1071ⅹ1051ⅹ1061ⅹ1031ⅹ1021ⅹ1049 mL无菌水3.操作流程①铲取土样，将样品装入纸袋中②将10 g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。1ⅹ1090 mL无菌水1mL③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。1mL1mL1mL1mL1mL10 g（二）微生物的选择培养放入37℃恒温箱中培养1～2d4.培养与观察稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照恒温培养箱待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d，在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。（二）微生物的选择培养4.培养与观察（二）微生物的选择培养培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，为什么？培养未接种的培养基的作用是对照。未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键，如果无菌落生长，说明了什么？未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。（二）微生物的选择培养注意事项：1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，在计算时，不要忽略；2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证；3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。常用微生物分离方法比较比较 平板划线法 稀释涂布平板法工具 接种环 涂布器原理 在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落。 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。特点 方法简单，但不适宜计数 单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂。结果共同点 使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落以上两张图分别是平板划线法和稀释涂布平板法培养细菌的结果。如果要对菌落进行计数，则哪种方法可行？为什么？得到的细菌数量是确切的细菌数量吗？（三）微生物的数量测定1.间接计数法——稀释涂布平板法（1）原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照（三）微生物的数量测定1.间接计数法——稀释涂布平板法（2）计数原则① 一般选择菌落数为30～300的平板计数。② 在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。③ 适当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照（三）微生物的数量测定1.间接计数法——稀释涂布平板法（3）结果分析①统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；②统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。（4）计算公式每克样品中的菌落数＝(C÷V)×MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M代表稀释倍数。例1.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )A.2.34×108 B.2.34×109C.234 D.23.4B思考：某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230；乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。请评价这两位同学的实验结果的有效性：1.甲同学________________；原因是________________；2.乙同学________________；原因是_____________________________；实验操作不合理未设置重复实验组结果计算不合理21与另外两组数值相差太大，应舍去（三）微生物的数量测定1.间接计数法——稀释涂布平板法（5）使用范围可以用来测定土壤、水、食品等样品中的细菌、酵母菌、芽孢和孢子等的数量，但不适于测定样品中的放线菌、丝状真菌等丝状体微生物的数量。2.直接计数法——显微镜直接计数1.原理利用特定的__________或____________在______下观察、计数，然后再计算________的样品中微生物的数量；*血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等；细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。2.优点________3.缺点（1）统计结果一般是_________________，不能区分死菌与活菌。（2）个体小的细菌在显微镜下难以观察。细菌计数板血细胞计数板显微镜一定体积快速直观活菌数和死菌数的总和进行实验1.实验目的（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。2.实验原理绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分离尿素的细菌。葡萄糖 10.0g尿素 1.0gKH2PO4 1.4gNa2HPO4 2.1gMgSO4·7H2O 0.2g琼脂 15.0g蒸馏水 1000ml①提供无机盐；②调节pH。CO(NH2)2+H2O脲酶2NH3+CO2常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践实验流程：微生物的培养与观察土壤取样样品的稀释实验设计进行实验注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。3.实验步骤（1）土壤取样① 取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。② 取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践进行实验3.实验步骤① 测细菌数：一般用104、105、106稀释液。② 测放线菌数：一般用103、104、105稀释液。③ 测真菌数：一般用102、103、104稀释液。（2）样品的稀释与涂布平板不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养；例如可以将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布平板上培养，以保证能从中选择出菌落数为30～300的平板进行计算。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）；整个实验还要设置2个平板：不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。进行实验3.实验步骤（2）样品的稀释与涂布平板土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践注意事项：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。进行实验3.实验步骤（2）样品的稀释与涂布平板土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践① 培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。② 观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。③ 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。（3）微生物的培养与观察进行实验3.实验步骤土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究实验结果分析与评价每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）；整个实验还要设置2个平板：不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。1.说出下列各组培养基目的。（1）3组接种得选择培养基：（2）1组接种的牛肉膏蛋白胨培养基：对土壤中分解尿素的细菌分离和计数。判断选择培养基是否具有选择作用。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践结果分析与评价每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）；整个实验还要设置2个平板：不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。1.说出下列各组培养基目的。（3）不接种的选择培养基：（4）不接种的牛肉膏蛋白胨培养基：验证选择培养基中是否含有杂菌。验证牛肉膏蛋白胨培养基中是否含有杂菌。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践结果分析与评价2.说出以下现象对应的结果分析。现象 分析未涂布培养基上无菌落生长未涂布培养基上有菌落生长牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数木培养基未被杂菌污染培养基被杂菌污染选择培养基具有选择作用土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践结果分析与评价3.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践结果分析与评价4.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30~300的平板？在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近？如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践结果分析与评价5.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学统计的结果接近吗？如果差异很大,可能是什么原因引起的？如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基配制是否合理等方面查找原因。土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌,对分离的菌种进行鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料,进一步设计实验来鉴定自己分离的菌种。进一步探究土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。1.原理在以尿素为唯一氮源的培养 基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。这样，我们就可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。进一步探究2.方法土壤中分解尿素的细菌的分离和计数探究·实践脲酶的检测小结:二、微生物的选择培养和计数1.空气中微生物总数的检测？2.水中细菌总数的检测？3.牛奶中细菌的分离与计数？4.土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数？练习与应用一、概念检测1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）（2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ）（3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）√√√一、概念检测2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（ ）A. 菌落中的细菌数目是固定的B. 平板上的一个菌落就是一个细菌C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌D练习与应用二、拓展应用1.反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。二、拓展应用2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。提示：可以参考本节“探究·实践”中的设计思路进行设计。二、拓展应用2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？提示：纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。二、拓展应用2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。提示：这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。谢谢让课堂绽放魅力 让教育更加美好

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