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作者：

王雅洁

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摘要：

本论文主要研究的是磁性四氧化三铁纳米颗粒的制备及其在生物医学中的应用.实验分为两个部分,第一部分将研究葡聚糖包裹的四氧化三铁纳米颗粒的制备,修饰及其在基因治疗中的应用;第二部分主要是高温分解法制备四氧化三铁纳米晶体,表面修饰后用于标记骨髓间充质干细胞的性能研究. 第一部分 传统的基因治疗方法大都缺乏靶向性,严重地阻碍了基因治疗研究的快速发展,开发新的基因载体是增强基因治疗靶向性的关键问题.纳米技术的发展,为解决基因转移载体问题提供了新的思路.体积微小,具有超顺磁性的氧化铁磁性纳米颗粒,有望成为理想的基因载体材料.本论文第一部分研究拟制备具有磁性靶向功能的基因治疗载体,体外转染肝癌细胞,通过观察磁性纳米微粒对目的基因的靶向转移作用,探讨磁性纳米材料用于靶向基因治疗的可行性,为基因治疗和靶向治疗探索一条新的途径. 应用共沉淀法制备了葡聚糖包裹的氧化铁纳米颗粒(DION).透射电镜(TEM)检测显示其直径约10nm,分布均匀,分散状态良好;振动样品磁力计(VSM)分析结果表明DION具有超顺磁性.为了能够结合DNA,我们在DION表面修饰了聚乙烯亚胺,成为PEI-DION,粒径在155nm左右.凝胶阻滞实验证实PEI-DION在与DNA质量比为4:1时,能有效结合DNA.采用MTT实验检测了PEI-DION对NIH/3T3的细胞毒性,结果显示PEI-DION的细胞毒性很小.以编码绿色荧光蛋白的基因EGFP-C1为报告基因,PEI-DION体外转染HepG2细胞以考察PEI-DION体外基因转染的能力.结果显示PEI-DION可携带外源基因在HepG2细胞中表达,在PEI-DION与DNA质量比为6:1时转染效率最高,流式细胞仪检测此时的细胞转染效率为52.73%.由于PEI-DION具有超顺磁性,在外加磁场的作用下可进行定向移动,实行靶向的基因治疗.实验中我们以编码β-半乳糖苷酶的基因LacZ为报告基因,在外加磁场的作用下体外转染HepG2细胞,X-gal染色结果表明PEI-DION可将DNA靶向释放到磁场区域的细胞中并表达目的蛋白. 第二部分 细胞标记在基础细胞生物学及再生医学研究中起着越来越重要的作用.随着干细胞研究的不断深入,干细胞移植已在多种疾病的治疗中显示出巨大的潜力和广阔的应用前景.移植细胞的分布和迁移的分析对干细胞治疗的研究至关重要.目前多采用荧光探针(如DAPI,DiI),核酸标记(如BrdU),转基因标记(如EGFP,lusiferase)等作为标记物,通过离体组织的病理学观察来判断细胞移植情况,这不符合未来干细胞临床应用的需要.近年来,磁标记技术因其操作简便,毒性低,标记效率高以及其特有的磁性能而吸引了越来越多的关注.本论文第二部分研究内容将集中在制备超顺磁性纳米晶体,探讨其用于标记大鼠骨髓间充质干细胞的可行性,优化标记浓度,提高标记效率. 通过乙酰丙酮铁和长链的二元醇在有机溶剂中高温分解的方法制备油溶性单分散超顺磁性氧化铁纳米晶体,并利用X-射线粉末衍射(XRD),TEM,VSM对所得粒子的晶体结构和物理性质进行了表征.结果表明粒子为具有尖晶石结构的Fe3O4,直径为10nm左右,分散性良好,无团聚,具有超顺磁性,饱和磁化强度为38.6 emu/g.然后通过表面修饰2,3-二巯基丁二酸(DMSA)的方法制备了水溶性氧化铁纳米颗粒,红外分析和热重分析结果表明我们成功将DMSA偶联到Fe3O4晶体表面,使油溶性Fe3O4纳米晶体转变成了水溶性纳米颗粒. 使用不同浓度的WION标记大鼠MSCs,通过普鲁士蓝染色和细胞计数法对WION标记效率和细胞毒性进行检测,进而优化出最佳标记浓度为10μg/ml.传代WION标记后的MSCs,结果表明随着细胞的增殖分裂,MSCs中的铁含量逐渐降低.采用MTT法和荧光染色法鉴定WION标记后对MSCs生长和调亡情况的影响.结果表明,WION标记对MSCs的生长,增殖能力没有任何影响,MSCs的凋亡情况也未受到影响.

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关键词：

超顺磁性 四氧化三铁 氧化铁纳米颗粒 生物医学 骨髓间充质干细胞 基因治疗 标记 纳米晶体 靶向 体外转染 细胞毒性 表面修饰 转染效率 氧化铁磁性纳米颗粒 细胞移植 外加磁场 实验 流式细胞仪检测 基因载体 高温分解

学位级别：

硕士

学位年度：

2008

DOI：

10.7666/d.y1798031

被引量：

1