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原标题:腺病毒 —— 一种被广泛应用的基因治疗载体 腺病毒 —— 一种被广泛应用的基因治疗载体 腺病毒(AdV)是无包膜的双链DNA,基因组含有大约26-48kbp。20世纪50年代首次被分离得到,能够引起上呼吸道、下呼吸道,胃肠道或者眼睛有症状的感染。直到20世纪80年代,腺病毒作为基因递送载体的治疗潜力才被发现。腺病毒是用于人类的第一种病毒基因传递载体,多于60种类型的人腺病毒被发现,其中Ad5(adenovirus serotypes 5)型的载体被广泛用做基因递送载体。 一、腺病毒作为基因递送载体 优势 1. 腺病毒的生物学功能已经被研究的非常清楚,这使得可以很容易的对其基因组进行操作; 2. 一些不同种类的腺病毒在人体中具有低毒力或无毒力,并且对于分裂和非分裂细胞均具有高转导效率; 3. 成本可控,可以获得非常高的滴度和产量; 4. 腺病毒不能整合到宿主基因组,使其具有非常低的插入突变风险; 5.腺病毒载体已经被用于溶瘤治疗以及疫苗抗原的表达; 劣势 1. 不能长期表达; 2. 高免疫原型,特别是在高剂量的情况下可能带来严重的毒性反应; 二、腺病毒载体的类型 根据病毒基因的缺失情况,腺病毒载体大致分为三种类型: 第一代腺病毒载体 病毒基因组缺失E1区或者E1&E3区。E1区的缺失导致腺病毒载体不能复制,同时增加载体容量。E1区缺失的载体只能在表达E1蛋白的细胞系中生产比如HEK 293。但是,第一代腺病毒载体由于同源重组可能会由于同源重组,可能会产生具有复制能力的病毒。 第二代腺病毒载体 最小化了第一代腺病毒载体的缺点。第二代病毒载体同时缺失E1&E3& E2/E4。这样的确实可以降低载体的免疫原性,同样也增加了载体容量,相比第一代,载体容量更大。但是这样就导致需要一种适当的细胞来保证病毒的复制繁殖。 第三代腺病毒载体 一种辅助质粒依赖病毒载体,移除了所有的腺病毒基因,仅仅保留了病毒基因的ITR和包装信号。非常显著的降低了免疫原性,使其更适合作为基因传递载体。其载体容量相比第一代和第二大变得更大。同时辅助质粒使用cre/loxp系统,使得产生的辅助质粒病毒基因组不含有包装信号,安全性更高。第三代腺病毒在不同动物模型均具有最小的副作用。 展开全文三、腺病毒载体包装方法与技术 主要有两种方法 1. 单质粒形式即直接在病毒基因组质粒上使用特定的内切酶插入外源基因; 2. 双质粒形式即利用同源重组在细菌或者细胞系内完成重组。双质粒形式包换两个质粒:基因组质粒和穿梭质粒。基因组质粒进行了适当的缺失,几乎包含全部腺病毒基因组。穿梭质粒包含外源基因以及能够保证成功同源重组以及产生具有感染能力的病毒的关键基因组序列。 实现同源重组的技术 1.细菌体内进行同源重组; 2.哺乳动物细胞内cre/loxp介导的同源重组。 四、腺病毒用于基因治疗的临床试验 数据来源于:http://www.abedia.com/wiley/vectors.phps 欢迎登陆吉凯基因网上商城查看腺病毒等。吉凯基因腺病毒载体包装系统简单介绍: 吉凯采用 Frank L.Graham 教授建立的 AdMax 腺病毒包装系统进行腺病毒包装,将携带外源基因的腺病毒穿梭质粒和不携带腺病毒大部分基因组(E1/E3 缺失)的辅助包装质粒共转染 HEK293 细胞,利用 Cre-loxP重组系统,即可产生携带外源基因的非复制型重组腺病毒,如 Fig. 1。 该包装系统操作简便,能够实现高效重组、病毒高产率及目的基因高表达。AdMax 腺病毒包装共涉及两个质粒,分别为: 1. 携带目的基因戒靶点序列的工具载体质粒(吉凯推荐 GV314、GV135 载体等); 2. 腺病毒包装辅助质粒(PBHG); Fig.1 Admax TM 重组腺病毒流程 吉凯基因参照经典的脂质体法进行两质粒共转染HEK293 细胞。在转染完成后的 10-15 天进行出毒判定,根据不同的实验需求进行毒种扩增,采用相应的浓缩纯化方式,得到高滴度的腺病毒保存液,并制定严格的质量标准测定腺病毒的各项指标。在一定滴度范围内的腺病毒可以满足大部分体内外实验需求,腺病毒生产流程图如 Fig. 2。 详细包装步骤请登陆吉凯基因网站商城进入【资讯】查看《吉凯基因腺病毒载体包装方法步骤》。 Fig.2 腺病毒生产流程图返回搜狐,查看更多 责任编辑: |
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