3. 作用机制分析

目前有两种主要的观点：如图2，一种认为在大肠杆菌细胞内发生同源重组的过程中产生了一种两端有单链挂钩的dsDNA中间体。如图3，另外一种观点则认为产生一种ssDNA中间体（另外一条链被Exo完全降解掉了）。研究者认为这两种中间可能都存在，但是ssDNA占据主导地位。从这里我们可以看出外源DNA片段是在DNA复制的时候，与染色体发生同源重组来替换掉靶标基因。

图2.lambda Red介导的dsDNA重组机制

图3. Lambda Red 介导的 dsDNA 重组通过 ssDNA 中间体进行

1. 根据敲除基因设计同源臂序列，构建敲除载体，将敲除载体转染到细菌内;

2. 在Red重组酶作用下，敲除载体与目的基因发生同源重组，目的基因被抗性基因替换，通过抗性基因富集敲除菌株。

Ellis、Court和Stew art等研究发现在Red系统的bet因作用下可以启动E.coli染色体和短的单链寡核苷酸序列间发生重组，导致基因的敲除或置换，因此目前广泛用于原核生物的基因敲除。

Red重组系统相对于宿主菌来说是一个外来的功能单位，其重组蛋白表达时在宿主菌内诱导形成“hyper-rac”状态，这种状态将对宿主菌本身的同源重组系统产生影响，从而对菌体本身造成伤害。因此必须对Red重组系统的表达进行控制。一种方法是将λred基因克隆到低拷贝质粒，在诱导型启动子控制下适量表达。Datsenko和Wanner构建了一个Red辅助质粒,包含 araC-ParaB启动子和gam、bet和exo三基因片段。由于质粒上具有核糖体结合位点，在阿拉伯糖诱导下Red蛋白可以有效的转录表达，同时它还是一个温度敏感型复制子，当实验中不需要时可以不让其表达。另外一技术是将E.coli的recC-ptr-recB-recD基因簇与red基因置换。置换后的菌株，在敲除已知E.coli 的重组基因的同时保持菌株的活力，而且细胞不再承受携带 red 基因的辅助质粒。DaiguanYu等发展了这一技术，利用温度敏感性λ cI抑制子控制λ原菌体PL操纵子，从而使exo、bet 和gam基因在42℃时表达，32℃时终止。从而保证了Red重组系统在宿主菌中进行瞬时表达，完成靶向基因的敲除，同时也不会或减少了对宿主菌本身重组系统的影响。

作者：海星生物

公众号：海星生科技 / 苏州海星生物

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