在酶切连接克隆及TA克隆中，都会借助T4 DNA连接酶将插入片段连入载体中。你是否好奇T4 DNA连接酶的原理？T4 DNA连接酶在酶切连接克隆及TA克隆中又是如何将片段与载体连接起来的呢？今天的克隆小讲堂就为大家分享T4 DNA连接酶的原理和应用。

01什么是T4 DNA连接酶

T4 DNA连接酶属于DNA连接酶的一种。DNA连接酶在体内可以催化双链DNA中单链DNA断裂处生成磷酸二酯键。DNA连接酶在生物体内有重要的生物学功能。在DNA修复和重组中，DNA 连接酶起到将缺口连接的作用。在DNA复制过程中，后滞链的合成是不连续的，由DNA连接酶将不连续的DNA链连成连续的DNA链。

DNA连接酶根据辅因子的不同，可分为2类：ATP依赖的连接酶和NAD+依赖的连接酶。T4 DNA连接酶是首个被发现的ATP依赖的DNA连接酶。

在酶切连接实验中，制备线性化载体和插入片段时，会使用相同的限制性内切酶消化载体和片段，限制性内切酶能识别特异的双链DNA序列，以内切的方式水解核苷酸链中的磷酸二酯键，产生特异的DNA片段，片段5' 端为磷酸基团，3' 端为羟基。T4 DNA连接酶可以催化相邻的5' 磷酸基团的末端和3' 羟基的末端，生成磷酸二酯键。

02T4 DNA连接酶的作用原理

T4 DNA连接酶的作用过程可以分为3个步骤。

第一步：连接酶的赖氨酸活性位点对ATP的α-磷酸基团亲核攻击，释放PPi，并生成T4 DNA连接酶-AMP中间体。

第二步：DNA链的5' -磷酸基团攻击连接酶-AMP中间体，AMP被转移到DNA链的5' -磷酸基团上，生成DNA-腺苷酸中间体。

第三步：DNA链的3' -羟基进攻5' -磷酸基团，形成磷酸二酯键，释放AMP。

03T4 DNA连接酶在克隆实验中的应用

应用场景1

酶切连接——单酶切，粘性末端的连接

当使用单酶切的方法制备线性化载体和插入片段时，如果载体和插入片段的末端是粘性末端，因片段的粘性末端是相同的，插入片段无论正向还是反向，插入片段突出的末端都能与载体突出的末端配对，形成氢键，在T4 DNA连接酶的作用下5' -磷酸基团和3' -羟基生成磷酸二酯键，这样插入片段就连入了载体中。

此外，单酶切制备的载体，其自身的末端可以配对形成氢键，并在T4 DNA连接酶的作用下5' -磷酸基团和3' -羟基生成磷酸二酯键，也就是载体自连。

为避免载体自连，可以使用碱性磷酸酶处理纯化后的线性化载体，碱性磷酸酶可将载体5' 末端的磷酸基团去掉，这样载体就无法自连，而插入片段的5' 末端有磷酸基团，可以在T4 DNA连接酶的作用下与载体3' 末端的羟基生成磷酸二酯键，插入片段的3' 末端与载体的5' 末端之间有一个缺刻，可在大肠杆菌中进行修复。

应用场景2

酶切连接——双酶切，粘性末端的连接

当使用双酶切的方法制备线性化载体和插入片段，如果得到的末端是粘性末端，因载体的粘性末端与插入片段的粘性末端是一一对应的，因此插入片段连入载体的方向是固定的。

插入片段突出的末端与载体上相对应的突出末端配对，形成氢键，在T4 DNA连接酶的作用下5' 末端的磷酸基团和3' 末端的羟基生成磷酸二酯键，这样插入片段就连入了载体中。

应用场景3

酶切连接——平末端的连接

当使用酶切方法制备线性化载体和插入片段，如果得到的末端是平末端，那么插入片段与载体的连接不需要碱基互补配对，只需要5' 末端的磷酸基团和3' 末端的羟基在T4 DNA连接酶的作用下生成磷酸二酯键。

平末端的载体自身也能在T4 DNA连接酶的作用下发生自连。避免载体自连的方法与应用场景1相同。

应用场景4

TA克隆

TA克隆所用的载体是T载体，3' 末端突出一个T。插入片段通过PCR方法扩增制备，利用Taq DNA聚合酶优先在PCR产物的3' 末端添加一个A，可与T载体3' 末端突出的T配对，形成氢键。PCR产物的5' 端也就是引物的5' 端，通常情况下5' 端是羟基，没有磷酸基团。而T载体的5' 端是磷酸基团，在T4 DNA连接酶的作用下，与PCR片段的3' 羟基生成磷酸二酯键，互补链上的缺口在转化到感受态细胞中可以进行修复。

今日的克隆小讲堂分享内容到这里就结束了，关于T4 DNA连接酶的原理和应用，你了解了吗？如果大家还对于克隆方面的其他技术原理感兴趣，想了解的话，欢迎给小V留言，小V下次再给大家分享。

参考文献：

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