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作者：

卢丹逸

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摘要：

目的: 生物碱是一类含氮有机化合物,其包含许多天然产物(如喜树碱,麻黄碱,乌头碱,士的宁)和合成药物(如普鲁卡因,三氟拉嗪,阿米替林).生物碱具有广泛的药理活性,如抗病毒,抗菌,抗癌,抗炎及抗抑郁活性.N-葡萄糖醛酸化代谢(NG代谢)是多种叔胺生物碱在人体内重要的代谢途径,可极大地影响叔胺生物碱在体内的浓度,从而改变其药效/毒性.然而,叔胺生物碱的NG代谢行为和规律尚不明确,其影响因素仍需阐明.本论文研究将评价葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)在叔胺生物碱NG代谢中的作用,阐明外排转运体和核受体对NG代谢的调控效应及作用机制.具体研究目标如下:(1)建立NG代谢的体外评价体系,测定叔胺生物碱的NG代谢活性;(2)评价UGT1A4和UGT2B10在叔胺生物碱NG代谢中的作用,考察NG代谢的种属间差异;(3)明晰外排转运体对NG代谢产物的外排作用,考察其对NG代谢的调控效应;(4)明确调控NG代谢的关键核受体,阐明调控机制. 方法: 1.采用UGT1A4和UGT2B10特异性底物(三氟拉嗪,可替宁和阿米替林)建立NG代谢的体外代谢体系.考察缓冲盐种类,pH值,打孔剂,MgCl2浓度,UDPGA浓度和β-葡萄糖醛酸苷水解酶抑制剂对NG代谢的影响,优化体外代谢条件.在优化条件下测定叔胺生物碱的NG代谢活性,采用液相-质谱联用法对生成的N-葡萄糖醛酸苷进行鉴定.此外,采用UGT1A4和UGT2B10重组酶测定两者对叔胺生物碱的代谢活性. 2.对六种生物碱(米氮平,米安色林,苯甲嗪,氯苯甲嗪,士的宁和马钱子碱)的NG代谢进行全面表征,包括单酶筛选,动力学测定,活性相关性分析,代谢抑制实验和种属代谢差异分析.明晰UGT1A4和UGT2B10对生物碱NG代谢的贡献程度. 3.采用慢病毒转染法构建UGT2B10高表达HEK293细胞(简称为HEK2B10细胞).通过qPCR法,蛋白免疫印迹分析和活性检测对该细胞模型的UGT2B10表达及活性进行测定.测定三种生物碱(阿米替林,米安色林和苯甲嗪)在HEK2B10细胞中的代谢和代谢物外排.通过化学抑制法(MK571和Ko143)和生物抑制法(shRNA),明确外排转运体(BCRP和MRP4)对NG代谢的调控效应. 4.采用qPCR法测定代谢酶调控核受体在HepG2细胞中的表达.考察核受体激动剂对细胞中UGT2B10表达和活性的影响,明确调控UGT2B10的关键核受体.结合启动子报告基因分析,凝胶迁移分析和染色质免疫共沉淀分析等分子生物学技术阐明关键核受体对UGT2B10的调控机制. 结果: 1.建立了NG代谢体外评价体系 根据特异性底物最大代谢速率原则,我们建立了NG代谢体外评价体系.该体系含:100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4),4mM MgCl2,20μg/mL alamethicin,及8mM UDPGA.采用该反应体系,我们准确测定了三氟拉嗪(UGT1A4特异性底物),可替宁(UGT2B10特异性底物)和阿米替林在个体肝微粒体中的代谢活性.阿米替林(5和100μM)的代谢速率与可替宁(2mM)的代谢速率显著相关(r>0.8,p