高效液相色谱分析 (HPLC) 是一种广泛的分析化学技术，用于分离化学混合物中的化合物。这些分离利用了以下原理：流动相在压力驱动下流经装有固定相的色谱柱。

HPLC 基础知识

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HPLC 色谱图示例

流动相带着液体样本流经色谱柱来到检测器，化合物或分析物因与固定相进行不同程度的相互作用而分离。

检测器测量从色谱柱洗脱的分析物，而色谱分析数据系统 (CDS) 则转换检测到的信号。 

从 HPLC 分析输出的经转换数据称为色谱图，其中 x 轴是时间量度，y 轴测量检测器生成的特定信号。   

分析物 – 要在 HPLC 分析中检测的感兴趣目标化合物

流动相 – 流动的相，由从进样位置流至检测位置的溶剂或洗脱液组成 

固定相 – 分析物发生物理分离之处的静止相

流速 – 流动相流动得有多快

保留时间 – 进样与色谱图中分析物的最大峰信号之间的时间

效率 – 以理论板数表示，这是量化分离性能的关键指标    

分辨率 - 区分峰和发现任何分离主要问题的能力 

选择性 – 分离两种分析物的能力

空隙体积 – 色谱柱内未被固定相占用的所有体积。

检测限 – 能可靠检测的分析物最少量

定量限 – 能可靠定量的分析物下限数量或上限数量

Mikhail Semyonovich Tsvet 因发明液相柱色谱分析法而备受赞誉。1901年，他提出了吸附色谱分析法，用填充了碳酸钙的细玻璃管分离植物色素与石油醚。Tsvet 在1903年发表了他的成果并测试了126种不同的粉末吸附剂。他是使用“色谱”一词的第一人（在其1906年印刷的论文中）。

40年后，在1941年，Archer John Porter Martin 和 Richard Lawrence Millington Synge 发表了一种新型分配色谱法，这种方法利用色谱柱中的硅胶使水静止，而氯仿则流经色谱柱，从而分离氨基酸。

此实验开启了开发 HPLC 的潮流，不过，又过了30年，人们才使用泵来推送液相，使其流经填充柱。

如今，全球实验室都使用 HPLC 来鉴定和定量液体样本中的不挥发和半挥发化学组分。

HPLC高效液相色谱仪器有四个主要组件：用于输送流动相的泵、用于进样的自动进样器、用于分离样本化合物的固定相色谱柱，以及用于测定化合物的检测器。其他元件包括连接的毛细管和管路（使流动相和样本持续流过系统）和 CDS 包（控制 HPLC 仪器、分离、检测和结果评估）。

每种 HPLC 分析都包括以下步骤：

流动相开始流动。泵推送洗脱液或溶剂，使其以指定的流速流经系统。

进样。一旦样本进入流动相流路，便会随流动相一起从进样点流至色谱柱头。

化合物分离。化合物在色谱柱固定相发生物理分离。从色谱柱洗脱后，分离的样本组分会来到检测器。

分析物检测。使用根据特定性质生成的电信号检测目标分析物。

生成色谱图。CDS 将检测到的分析物信号转换成以分析物信号与时间表示的色谱图。

许多因素（包括流动相组成、固定相化学组成和温度）都会影响 HPLC 分离。仅当分析物对固定相具有差异亲和力时，才会成功分离，因此，为化合物选择适合的固定相至关重要。影响整个分离过程的主要因素有： 

所有 HPLC 分离均在这两种模式的任一下进行：等度或梯度。  

等度法在分析过程中使用一致的洗脱液组成（如100%乙腈或乙腈与水的50:50混合物）进行分离。    

而梯度法则在整个分离过程中使用不同的流动相组成。这些方法通常使用两种溶剂，称为 A 和 B。开始运行时 A 与 B 具有一定的百分比，例如60%的水与40%的乙腈，然后在整个分离过程中百分比会发生变化。

梯度分离的性能通常优于等度模式，但更加复杂，需要先进的泵硬件。 

鉴于化合物繁多的数量且潜在分析物的多变结构，HPLC 极少出现一法百用的情形。从纳米到制备规模分离，下面列出了最常用的 HPLC 技术类型以及各自的应用情形。

高效液相色谱分析法专为 3-5 µm 的固定相颗粒而开发，运行时的工作压力高达 600 bar，流速介于 1-2 mL/min 之间。 标准 HPLC 是各行各业使用较为广泛的液相色谱分析类型。

超高效液相色谱分析 (UHPLC) 法可从基于 低流速液相色谱分析

低流速液相色谱分析 包含了从低 nL/min 到大约 50 µL/min 的纳米流、微流和毛细管流范围，由于色谱柱内径连带下降，导致分析物条带的稀释度降低，这种分析法具有更高的灵敏度。由于流速与电喷雾电离效率之间呈相反关系，这些分析通常与质谱分析配套使用，可显著提高方法灵敏度。

制备型 LC 技术涉及 将分馏的洗脱液收集到分立式样本容器中，以分离一种或多种分析物，从而纯化主要组分或分离杂质以供进一步研究。制备型 LC 分离分为三类：分析、半制备和制备，而分离目标决定了规模、 色谱柱尺寸和流速。

二维液相色谱分析 (2D-LC) 是一种先进的分离技术，其连续使用两根化学组成互补的色谱柱进行多维分离，而不是让样本流经一根色谱柱。色谱工作人员可采用三种独特类型的 2D-LC 方法，利用多色谱柱选择性来提高样本分辨率。

全面 2D-LC。整个样本在第一维 (¹D) 色谱柱中分离，随后在另一根互补的第二维 (²D) 色谱柱上分离。

定量环中心切割 2D-LC。使用样本定量环自动从第一维 (¹D) 色谱柱切割特定的洗脱液组分，以转移至互补的第二维 (²D) 色谱柱。

捕获中心切割 2D-LC。可让您自动从第一维 (1D) 色谱柱切割单个洗脱液组分并捕获到捕获柱上。捕获法可预浓缩低丰度分析物并在该组分洗脱到第二维 (2D) 色谱柱之前解决溶剂不相容问题，从而解析复杂峰或共洗脱峰。

双液相色谱分析是一种多通道 HPLC 方法，其在单个系统中使用两个独立的流路，以同时运行两项分析。这些 HPLC 系统具有两个泵（带有两条独立的溶剂路径）、两个计量装置（位于自动进样器内）和两个检测器，但体积与单个 HPLC 系统相同。

串联液相色谱分析技术使用另一个泵和智能色谱柱切换，通过尽量减少与色谱柱重新平衡有关的停机时间，较大限度地提高检测器的利用率。 串联梯度运行分为两个主要部分：当泵二重新平衡时，泵一将分析梯度输送至色谱柱一。然后，当泵二重新平衡色谱柱一时，泵一将分析梯度输送至色谱柱二。

梯度洗脱中有机成分的变化可能会导致某些检测器（如电雾式检测）的分析物响应出现波动并使分析变得复杂。柱后应用反梯度补偿可消除此效应，因为它可确保进入检测器的洗脱液在整个梯度分离过程中都具有确切的溶剂成分。

HPLC高效液相色谱的分离原理基于样本化合物在流动相（来自泵）和固定相（在色谱柱中）之间的分布。经过色谱柱时，化合物基团与固定相发生不同的相互作用并视化学特性而被保留，因此出现了分离。

泵输送流动相，使其经过填充了固定相的色谱柱。自动进样器将样本注射到色谱柱上。固定相分离样本化合物或分析物。检测器测量从色谱柱分离和洗脱的分析物。

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