1. 应用说明

三磷酸腺苷(Adenosine Tri-Phosphate, ATP)是自然界中各种生命活动中共用的能量载体，是能量储存和转移的最小单位。ATP参与生物体内多种酶促反应，维持正常的生命活动，是活细胞新陈代谢的一个指标，ATP的含量直接反应了细胞的数量及细胞状态。通过检测ATP含量，可以检测出细胞的增殖情况。

Turner公司Modulus微孔板多功能光度计和Promega公司的CellTiter-Glo™萤光素酶试剂盒联合使用为活细胞数定量提供了一种方便、快速且灵敏的方法。CellTiter-Glo™活细胞检测试剂盒采用萤光素酶作检测物，因为哺乳动物细胞中没有内源萤光素酶的干扰，试剂盒中使用UltraGlow萤光素酶生成的稳定辉光型信号，半衰期超过4h。超长的发光信号为多板同批检测提供了基础。发光过程中萤光素酶需要ATP的参与，有代谢活性细胞的呼吸作用和其他生命活动过程可以产生ATP。向细胞培养基中加入等体积CellTiter-Glo™试剂，测量发光值，光信号和体系中ATP量成正比，而ATP又和活细胞数正相关。

CellTiter-Glo™发光活细胞检测系统使得检测试剂具有最高灵敏度和较长的信号持续时间，本系统已经广泛地应用在生命科学研究领域中。细胞活性分析是高效的“加样－混合－测量”系统，CellTiter-Glo™试剂和细胞培养中的常用培养基兼容，如RPMI 1640, MEM, DMEM, and Ham's F12，也不受酚红和有机溶剂的影响。

Modulus™微孔板多功能光度计较宽的动力学范围使用户在一个板子上就能对极弱和极强的发光样品进行检测。Modulus™上还有预设的CellTiter-Glo™试验操作方案，使用起来更为方便。用CellTiter-Glo™试剂和Modulus™微孔板多功能光度计进行检测最低可检测出ATP的量为1.5X10-15 mol。检测的线性范围从760 fg到5.1ng，超过4个数量级。

2. 所需器材● Modulus™微孔板型多功能检测仪(P/N 9300-001或9300-002，9300-003)● 96孔白板(E&K Scientific EK-25075)● CellTiter-Glo™发光活细胞检测 ● P200移液器和枪头

3. 实验方案

3.1 试剂制备CellTiter-Glo™底物：使用所提供产品。－20℃储存。CellTiter-Glo™缓冲液：使用所提供产品。－20℃储存，缓冲液溶解室温下稳定48h活性也不会丢失。CellTiter-Glo™试剂：将CellTiter-Glo™缓冲液倒入CellTiter-Glo™底物中，颠倒混匀，直到底物彻底溶解。混合试剂当天使用能性能最佳。混合试剂4℃储存1-2天，活性衰减5-20％。注：在定量检测中，CellTiter-Glo™试剂应始终保持室温，因萤光素酶活性会受温度影响。混合试剂冻存后再次使用，为确保试剂性能，应在低于25℃条件下溶解。溶解后充分混匀，最简单的方法是室温水浴溶解。

3.2 仪器准备

按照以下程序由主界面开始选择CellTiter-Glo检测程序：选择发光检测模式，选择CellTiter-Glo程序，结束。

在仪器的控制界面中显示了所有的控制参数：检测时间和板孔选择。如果需要，可以更改检测时间并另存为自己的程序。在微孔板图上选择需要检测的板孔（选中为绿色）

3.3 样品分析

在白色96孔板中加入相应的刺激物。使用空细胞作为空白对照，使用未加入刺激物的细胞培养孔作为阳性对照。

检测前将细胞培养板及检测试剂在室温下平衡30min

在每个细胞培养孔中加入100ul的CellTiter-Glo检测试剂，轻轻混合震荡2min。然后室温下孵育10min以稳定发光。

使用触摸屏上的“Door”按钮打开仪器舱门，将96孔板的A1对应仪器托盘右上角放入微孔板托盘，使用“Door”按钮关闭舱门。

点击“start”按钮开始检测

检测结果会直接在ModulusTM的屏幕上显示当所有的孔检测完成，可以使用U盘将检测数据转移到个人电脑中

然后将微孔板从仪器中取出

4. 结果

灵敏度：使用CellTiter-Glo可以检测到1.5X10-15moles ATP

检测范围：使用CellTiter-Glo可以检测到4个数量级水平的ATP

5. 相关文献

1. Crouch, S.P.M. et al. (1993) The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Meth. 160, 81.

编辑: yishuitan 作者:丁香园通讯员