实验室方法在化妆品功效评价中的应用：三层级、4M原则

在行业里我们都有哪些可选择的功效评价方法?

首先要强调的是，我觉得一个科学的化妆品功效评价一定是多维度的。

目前行业里主要有三个层级。 第一个层级，细胞分子的相关指标。比如说做一个抗氧化的，需测一个ROS指标，而做一个抗皱的，可以做一个IV型胶原蛋白指标等，这就是一个单分子指标的检测体系。

这里需要注意的是这个指标测试的结果与人体最终的功效差别多大是不确定的，这也是我们为什么鼓励做多层级数据的原因之一。

第二个层级，运用离体的组织，3D皮肤模型等，主要在组织维度的工具和方法上。基于这样的体系，我们可以在形态学上达到一站式的检测，这样可以把分子层面到真实的人体层面有更好的过渡。

第三个层级，在一些功效宣称的方向上，提取一些人体方面的数据支撑。

另外，在整体的实验室技术体系介绍里，它需符合四个M的原则，分别是机制 Mechanism、指标 Markers、模型 Models与方法 Methods。

机制 Mechanism：建立皮肤功效状态背后的细胞分子机制，因为我们做任何功效方向的评价、研究或者活性物选择都脱离不开对特定功效方向机理上的研究。

指标 Markers：从不同皮肤状态的产生机制得到对应的检测指标，用于反映皮肤功效的变化。

在机理研究层面上，会刻画出更易于检测和实施的靶标，这些都是在方法学里非常关注的指标。在这个指标之下，我们需选择合适的模型。

模型 Models：依据皮肤状态产生的机理，同时结合体外现有的基础模型筛选最佳的造模条件。

那么模型选择的依据是什么?首先模型Models要具备生理能力，第二模型需与评价对象的配伍和兼容。

方法 Methods：对于筛选的检测指标，在组织、细胞、蛋白、基因等不同水平选择对应的检测方法开发与验证。

我们会 通过一些现代分子生物学的方法，以及理化的方法Methods，对它进行测定，整体上形成评价技术的基本体系。

体外方法在化妆品功效评价上的应用及案例

我们曾接触到一家企业，他们有上百个特证产品，但是从未做过人体功效测试。这意味，他们产品卖了一两年缓冲期之后便下架，面临着重新开发新产品。但是我们知道法规规定的特证产品都是需要进行人体测试的，且行业那么大，产品这么多，有多少的比例是属于概念性添加?

提到人体测试时，不少人对此没信心。那么，在正式人体试验之前，有没有相关数据库能先帮大家进行分析等?接下来，我讲一下——体外方法在化妆品功效评价上的应用及案例。

1、美白功效

有些公司有一定开发技术基础如美白剂(具备一定的美白功效)等，如何进行体外的预筛，然后进行人体测试。

我们把产品涂抹在3D黑素皮肤模型的表面，通过一系列的指标，可以直观看到产品使用后皮肤模型表观颜色到底是白还是黑了。另外也可以测定表观亮度L值，黑素的分布和含量等相关指标。

我们来看一个具体的案例，雅诗兰黛专研光透焕白精华素。

我们可以看到色度，在UVB组的照射下，抹了该产品之后，色度明显比对照组要淡一些，这是非常直观的美白效果，其他的量化指标也能证明这点。右下角的组织学里呈现的黑素分布形态，其结果不仅可以告诉我们这个产品的原理到底是抑制黑素合成，还是抑制黑素的转运;同时可得知，如果组织学结构非常完好的话，这个产品的温和性很高。这是我们在美白上的应用。

2、防脱功效

关于防脱产品的功效，行业的信心度是很低的，行业里也缺乏真正有效的防脱天然活性原料。只能寻找更多天然或者中药的提取物来解决这个问题，然而有一些原料虽有一定的功效，但是功效表现不够惊艳。

从防脱机理来说，有三点。第一5α还原酶抑制剂；第二毛乳头生长期通过营养液调节；第三让休止期的毛发重新进入生长期。

另外 从评价技术来看，可以与医院合作——提取离体的毛囊，然后通过离体的毛囊，测生长毛囊的大小，还包括毛乳头一些凋亡的情况等。通过直观的形态学，再结合一些相关的因子表达，可以综合地分析待测的物质有没有防脱功效。

当然还可以做更深层次的研究，比如H2O2-毛乳头细胞(DPC)、DHT-毛乳头细胞(DPC)，可以检测到不同细化指标的毛乳头细胞的表现情况，这一体系不做详细介绍了。

回到防脱产品的开发情况，我觉得最主要需要找到一个切入点。到底是在生长期解决营养性的、因子性的问题，还是休止期解决毛囊干细胞重新激活的问题，这是第一步。

然后我们对于一个未知的提取物需结合网络药理分析，一方面分析这个原料物质可能存在的靶向基因;另一方面是对标的疾病，包括防脱，以及背后调控的相关基因。如左边这个图，其实前端的工作，至少整合了双边几千个基因做大量数据分析。

现在来看一下具体产品案例，是一个某乌发生发液。核心点主要是TGF-beta，AR，Wnt，PI3K-AKT这四个通路上。这里有一点要说明，如果有一个未知的物质，它的富集跟脱发相关，或者是抑制脱发相关的通路越多，它就更有可能在真正的产品端起到防脱的功效。分析完后，接下来可以做更多的延展性、细化的工作，这点是特别需要更多资源的投入。

这里有一个简单的离体毛囊的培养，分别有四个组别，可以直观看到在不同组别里毛发的生长的效果。另外也可在毛乳头区域，看到它凋亡的情况，像这个红色箭头指示区域，过几天这个毛发就会脱掉，如把这个现象抑制住，将会是一份非常直观的检测防脱功效的效果图证明。

我们在直观检验完之后，再配套产品的开发，从不同的通路进行包装，以提升我们产品科技的属性。

3、屏障修复

第三个案例，我想分享的是 屏障修复和抗炎，也叫免疫调控。

从评价角度来看，有两个核心的， 一个是免疫调控，是治标的问题;一个是屏障修护，如何主动加强皮肤表层屏障，以及砖墙结构的恢复功能。

目前，我们汇总的活性物和产品，大致从机理上分析，有三条主要的通路。第一条是 刺激性反应，第二条是 过敏性反应。中国无论是刺激现象还是神经性导致的过敏现象，都会叫过敏，但临床上，真正的过敏现象比例是较低的。第三是 神经性的敏感。最近比较火的像CBD，包括神经肽类，抑制神经递质分泌的都是属于这个类别。

所以从免疫调节角度来讲，所涉及到的指标，都可以从原料和评价分析作为切入点。

另外一个， 屏障修复。如果我们对皮肤的分化结构进行细致分析的话，屏障相关指标其实非常多，尤其EDC复合体，大概有65个基因左右，跟皮肤的屏障结构高度相关。此外，还有一些连接蛋白、骨架蛋白/KIFs等。所以我们在这里所提取的指标，就不单单是可以作为我们原料的包装点，也可以作为它的一个评价点。

举个例子，这是基于3D的皮肤模型做的染色的结果。我们可以看到，在不同的处理方式之下，FLG、LOR，都会表现出不同的表达丰度，尤其在NC对照下，这个FLG、LOR表达就会有一个显著下降。

还有前一段时间检测的雪果精华，通过SLS刺激表皮模型发现：刺激后表皮形态会退化，同时分泌出一系列的炎症因子，我们可以直观地看见产品看对炎症因子是否起到抑制作用，以及从免疫调控的角度来看产品的功效。

第二个方面，是FLG、LOR的CE屏障高度相关的蛋白质。可以看到阴性对照组，这个蛋白含量是降低的。加了这个产品之后，和阴性对照组比，有一个显著性的提升。通过这样的细分指标可以说明这个产品具有屏障主动修复的功效，而且和临床的正常皮肤屏障主动修复的相关性也是比较高的。

4、抗衰老

在抗皱方面，主要涉及到三个主要工具， 成纤维细胞、体外重组全层皮肤模型、离体皮肤组织。其中离体皮肤组织，化妆品可以在表皮上直接进行涂抹，这样可观察它整体的皮肤变化。

但这个技术体系有个难点，主要是长期培养。这个产品在相对长的时间里，看它对皮肤到底产生什么样的变化。首先我们要优先保障离体皮肤在体外能够维持两周以上的生长培养，但正常的细胞三天便全面地凋亡。

结合现有丰富的相关指标、检测模型，可以筛选用哪个活性物作为我们的配方。

首先需做个 初筛，这个初筛主要基于一些高性价比细胞模型，通过这个指标可以看到MMP和ROS抑制效果比较好，然后进行组合。

另外一些 可视化的结果，像胶原的分泌，可以帮助我们确定特定的原料以及它的功效。具体到产品，我们也会用到相关类似的方法，像刚才提到的ROS、MMP、COL1，还有一些更重要的，我们会 用三维的效果，来看它在组织形态上有什么综合的表现。

这是我们前一段时间接触的含视黄醇类的抗皱修复产品。这个产品通过组织学比较，与阴性对照组对比，可看到实验组表皮层增厚，这跟视黄醇的一些基础功能相关。第二看结构，比如I型胶原蛋白，表达丰度有没有提高。我们知道在衰老皮肤中，DEJ结构退化比较严重的。

同样我们也可在胶原纤维的染色密度上作比较，右边这个胶原分布密度图，远远高于阴性对照组，还可在弹性纤维表达分布上进行相关的检测。这样的检测结果更有利佐证产品在抗皱上的功效，同时也可以作为与其它产品差异化的功效包装。

说到差异化，行业里普遍用美白、保湿、控油等统称，所以我们应该考虑如何进行更好的差异化宣称。首先 差异化的宣称，它是为一级宣称服务的，我们可以衍生出更好的市场故事。比如修护，可用水润修复；其次把水润的 相关指标进行科学的关联。第三 把配方原料里的指标进行检测。这样一个逐层的逻辑，做到具体的实测指标，然后再倒推，通过这样的证据数据支持，来验证水润修复效果。

所以整个体系对皮肤分子机制的验证，细胞的靶向，包括匹配的原料和产品，是一个系统化的工程，这样可以达到差异化宣称的目的。

从整体上来看，化妆品功效的评价、功效产品的开发，都是从皮肤的生物学指标开始的。

我觉得这是一个新的时代，对我们做技术的人员来讲，是非常好的鼓舞。而这个生物指标，中间需要多维度的功效评价方法进行连接，目前没有一个独立的功效评价方法来解决所遇到的问题。

忠于消费者的体验，把消费者的价值最大化。虽然这里面涉及到方方面面的科学，但我相信把全行业整合起来，可以带来巨大的进步。

博溪生物一直在一线，专注于系列3D皮肤模型开发和产业化，专业聚焦于化妆品、口腔护理、发用品以及婴幼儿护理等产品的安全与功效评价，非常高兴有机会和大家分享我们的经验，谢谢大家。

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