由于新型佐剂种类各异，制造工艺和质量控制各不相同，疫苗-佐剂相互作用很难采用一般研究手段进行表征，因此新型佐剂疫苗的研究往往具有周期长、研发路径不明确、失败风险高等特点。本文尝试从新佐剂疫苗药学研究入手，试图对普遍存在的一些问题进行探讨和思考。

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疫苗佐剂的组成与作用机制

见表1。

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生产工艺

2． 1 佐剂制备工艺

新型佐剂大多是成分相对明确的化合物或几种化合物组合，这些化合物的制备工艺大多为化学反应、生物发酵和提取。例如，CpG 是通过化学反应制备而成的，MPL 是通过发酵从明尼苏达沙门菌分离得到的，而QS-21 是从皂树皮中提取而来的。此外，生物发酵和提取获得的化合物亦可由化学制备得到［1］。不同佐剂作用机制、效应靶点存在较大不同，佐剂的物质基础、结构也不同，如CpG 归为寡核苷酸、QS-21 归为皂苷，交叉的学科也较多，但笔者整体认为，化药工艺开发的通用技术指南适用于诸多佐剂成分; 同时佐剂-抗原复合物的免疫学效应研究是工艺开发的有力工具。

在EMA 的指导原则中，还特别强调佐剂原材料的来源，若动物源则更应重点关注传染性海绵状脑病( TSE) 风险［3］。

佐剂中化合物的制备方式多种多样，最理想的目的是为了获得化学结构正确、清晰可表征、批间一致性较好的目标成分( 混合物或者单体) ，因为其结构正确与否对佐剂和疫苗的功能及活性起到至关重要的作用。在探索化合物制备工艺之前，可对目标化合物进行充分的调研与筛选，以明确拟开发的目标化合物各类性质。化合物制备研究初期，往往制备规模小，工艺路线和方案不确定，此时应根据前期获得的相关数据对所制备样品开展充分的结构确证与质量控制，以判断工艺路线是否可行、成本合理并有较高的收率，从而持续地对制备工艺进行优化和调整。当获得结构正确、质量稳定可控的化合物后，可进一步开展中试和工业化生产工艺的研究，确定最终商业化规模的制备工艺［11］。

制备过程中会带入工艺相关杂质以及化合物自身降解产生产品相关杂质，均可能会对终产品质量和安全性产生影响。因此建议采用先进的理化检测手段对杂质进行控制，如高效液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法和毛细管电泳法。应综合考虑多个批次的杂质控制结果，制定合理的杂质限度［12 － 13］。

2． 2 新佐剂疫苗制剂工艺

随着质量源于设计( quality-by-design，QbD) 理念逐渐应用于疫苗开发中，从制剂研发阶段开始，研究者需要在制剂工艺开发中通过多个批次积累，透彻理解药品质量属性，在工艺设计、工艺参数选择、物料控制等方面通过深入研究，对关键工艺参数及其与关键质量属性( critical quality attribute，CQA)的关联以及潜在的高风险变量进行充分研究和筛选，确定最适制剂生产工艺，并保证在一定的设计空间内产品质量均能符合要求［14 － 15］。目前对于多数新佐剂疫苗，缓冲体系、添加顺序、反应温度等对疫苗终产品影响较为明显。

传统的铝盐佐剂疫苗中，佐剂与抗原以吸附的方式进行结合形成最终的制剂产品［16］。新佐剂疫苗由于种类众多，无法以相同的技术路线设计制剂工艺。有以吸附方式结合，如葛兰素史克公司的HPV 疫苗，AS04 佐剂系统中MPL 与氢氧化铝先进行吸附，再将氢氧化铝与抗原VLP 进行结合; 而在其重组带状疱疹疫苗中采用AS01 佐剂系统，抗原与佐剂分别包装，临用时再进行混合。佐剂与抗原包装方式的不同，一方面由于佐剂特性以及抗原-佐剂相互作用的影响，另一方面则重点考虑药效学研究结果，包括对细胞免疫和体液免疫的影响。

佐剂类型的选择及剂量探索是疫苗制剂研究中最关键的内容。研究者首先对疫苗保护机制进行充分调研的基础上选择合适的佐剂，例如: MPL 作为TLＲ-4 激动剂激活转录因子NF-κB 诱导IL-2 和IFN-γ 的产生，CpG 作为TLＲ-9 激动剂可激活浆细胞样树突状细胞和B 细胞产生Ⅰ型干扰素并上调CD40，CD68，MHC-Ⅰ/Ⅱ的表达。

此外，佐剂种类的选择应遵循尽量降低不良反应并且产生较高免疫原性的原则，例如在AS01 佐剂系统中，QS-21 具有溶血活性，采用胆固醇对其进行包封后既保留了生物活性，又在很大程度上降低了不良反应的发生［17］。佐剂的剂量探索主要依赖于动物实验，以获得保护力( 或免疫原性) 最优的剂量，但佐剂最终的剂量探索应在Ⅱ期临床研究中完成，如葛兰素史克公司的重组带状疱疹疫苗在Ⅱ期临床研究完成了AS01B /AS01E 的探索，最终选择了AS01B［18］。此外，佐剂与抗原为单独包装的疫苗终产品，则更应关注在混合注射后疫苗与抗原在动物体内的分布状况，从药效学角度来考虑制剂处方的组成。

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质量研究

3． 1 结构

随着结构疫苗学的发展，人们对抗原结构的研究与认识逐渐加深，佐剂以及疫苗-佐剂的结构确证同样也有越来越多的研究。佐剂中单独的化合物以及生物大分子在合成过程中会开展相对清晰的结构确证，通过红外、紫外、核磁共振和质谱研究等，可对其分子量、化学修饰、异构体等进行表征［11］。当佐剂与抗原结合后，由于佐剂种类的多样性形成的结合物结构尚无较好的方法进行表征。因此，在形成制剂之前对各组分进行充分的结构确证尤为重要。

3． 2 质量控制

WHO，FDA，EMA 和我国的相关指导原则均建议对佐剂、抗原和疫苗开展全面的质量控制。由于不同的抗原之间质量特性无法进行类比，因此本文仅对佐剂和疫苗终产品质量控制的一般技术要求进行讨论。

3． 2． 1 佐剂

由于制剂的大部分关键质量属性皆与原料药相关，因此其关键质量属性是原料药设计或其生产工艺的直接结果［15］。研究各种佐剂质量特性的过程中，在进行多批次的研究后，将对佐剂放行有重大影响的参数( 通常为CQA) 列为常规放行检测。检测项目大多包括理化检测( 如外观、密度、黏度、pH、分子大小分布、表面电荷等) 、生物学特性检测以及纯度检测( 如内毒素、生物负荷、工艺相关杂质等) ［5］。此外，对于目前已批准上市的疫苗佐剂，根据自身特性制定不同的产品相关杂质等质控项目。如MPL 的酰基含量、QS-21 的同分异构体、CpG 的硫代率等。此外，作为生物制品的开发，如适用，也建议建立佐剂单独的生物学效力质控标准。

3． 2． 2 佐剂系统

目前佐剂使用的复合化已经成为佐剂发展的一大趋势［19］，将佐剂系统中各组分作为整体进行研究逐渐受到重视。通过临床前及临床研究识别佐剂系统的CQA，建立的放行检验既包括佐剂系统制备过程中单个佐剂成分易发生改变的组分的控制，也应包括佐剂系统CQA 的控制。在合并多种佐剂成分以后，还应开展每种佐剂的质量特性研究，并对佐剂和抗原的预期组合进行配伍研究。

3． 2． 3 终产品

对于疫苗终产品的质量控制，首先应当评估每种抗原和佐剂成分的属性，当使用一种以上的佐剂和/或一种佐剂含有一种以上的成分时，应在当前认知范围内对每种佐剂及组分的功能进行充分的表征，因为这些项目可能会直接影响佐剂活性以及疫苗的保护效果。

疫苗质量研究中最重要的属性应为疫苗效力。传统疫苗效力的体现主要表现为抗体水平的增加，新佐剂疫苗可能同时有助于细胞免疫发挥效力，如免疫葛兰素史克公司的重组带状疱疹疫苗后，其保护作用与CD +4 T 细胞水平及对应的细胞因子水平更为相关［20］。所以应当开发可以充分评价佐剂疫苗效力的试验，以反映疫苗本身的作用机制、效力以及佐剂对疫苗效力的影响。在尚未开发出相关效力评价试验之前，通常先对佐剂进行鉴别和含量测定，保证佐剂在终产品中的质量可控。同样，在终产品的控制中无菌检测和内毒素检查是必不可少的。当疫苗的佐剂和抗原采用单独包装，在给药前将两者分别放在一个单独的容器中进行混合，则应在混合前对抗原和佐剂进行鉴别、纯度、无菌、抗原效力和佐剂含量的检测。

如果最终疫苗产品除佐剂-疫苗组合外还存在其他抗原，则必须评估附加抗原的免疫原性以及对佐剂抗原复合物的任何影响。若终产品包含一个以上的佐剂-抗原组合，则需要对佐剂的性质进行适当的测试，以观测不同佐剂-抗原组合之间发生的任何不良反应。

3． 3 抗原-佐剂相容性

抗原与佐剂的相容性在质量研究中非常重要，抗原的微环境和佐剂偏好的微环境可能不同，如何合理的开发制剂处方，利于抗原-佐剂系统的免疫原性及稳定性是关键。应整体评价佐剂和抗原之间、佐剂之间( 如使用佐剂系统) 的相容性和干扰［5］。首先应明确抗原与佐剂的结合机理及结合效率，在佐剂-抗原结合的生物学特性( 如吸附、结合特性) 至关重要等关键方面应给予研究和控制。研究项目包括抗原与佐剂结合的程度和一致性、抗原与佐剂结合的完整性、佐剂对检测抗原能力的影响以及从佐剂中释放抗原的程度( 稳定性) 。其他参数可能包括化学和物理特性( 如粒度、黏度等) ［3，5］。

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小结

随着对新型佐剂以及新型佐剂疫苗的不断研究和深入，目前现有的理论及研究手段随时会出现更新，甚至颠覆现有对新佐剂疫苗的认识。所以应当随时关注相关基础学科的研究进展以及监管机构对产品研发的相关要求，并适度调整研发思路和策略，促进新型佐剂疫苗研发的进步。

参考文献

详见 中国新药杂志 2020 年 第29卷第17期

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