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抗肿瘤药物诱导的心脏毒性已日益成为临床关注的一个焦点问题，而其发病机制仍然需要更深入和系统的研究。

01 研究摘要

为了探讨酪氨酸激酶抑制剂Tyrosine kinase inhibitors（TKIs）诱导心脏毒性的分子机制，我们选择8种不同心脏毒性水平的TKI，采用不同剂量和时间处理人诱导型多能干细胞分化的心肌细胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes，hiPSC-CMs），然后对表型和转录组进行分析。结果发现细胞水平的药物毒性与临床药物毒性一致性高，说明人心肌细胞是评估药物心脏毒性的良好模型。三种TKIs（阿法替尼、波纳替尼和索拉非尼）诱导的基因表达变化均富集在内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ER Stress），其中波纳替尼诱导的内质网应激在各种心肌细胞和大鼠动物模型中均发生。当ER Stress下游的PERK或IRE1α被抑制时，TKI诱导的心脏损伤，主要表现为心脏胎儿基因和炎症因子表达的增加，而不是心肌细胞的死亡，受到抑制。这表明ER Stress对于这三种TKIs诱导的心脏毒性是必需的。ER Stress及其下游的炎症因子是潜在的治疗靶点，对它们的抑制可能可以减轻波纳替尼和索拉非尼诱导的心脏毒性。

本文已刊登于Bmc Medicine。BMC Medicine 是 BMC 系列的旗舰医学期刊，创刊于2003年，由BMC出版商出版，收稿方向涵盖医学 - 医学：内科全领域，在行业领域中学术影响力很大，属于TOP期刊。刊登文章链接详见文末。

02研究内容

TKIs是肿瘤治疗领域中最常用的靶向药物，但是在抗肿瘤治疗的同时，可能会产生各种各样的不良反应。心脏毒性是靶向治疗中少见但是及其严重的不良反应。为了进一步探讨TKI诱导的心脏毒性发生机制，我们选择了不同类型的TKIs作为研究对象。按照其心脏毒性的高低可大致分为3类：心脏毒性高风险（索拉非尼、舒尼替尼、波那替尼），心脏毒性中风险（克唑替尼、达沙替尼、尼洛替尼）和心脏毒性低风险（阿法替尼、吉非替尼）。将这些药物按照不同剂量强度和作用时间，分别处理hiPSC-CMs，然后对TKI导致的细胞表型和转录组变化进行生物信息学分析。对RNA测序结果进行t分布随机邻域嵌入（T-distributed stochastic neighbor embedding, tSNE）分析，可以将具有较高相似性的转录组样本进行无监督聚类。基于tSNE分析，药物诱导的转录组变化被聚类为7个集群（图1a），在同一个集群内，不同的药物处理条件可诱导hiPSC-CM发生相似的转录组变化。将tSNE分析结果与药物处理条件进行一一对应后发现，7个集群的组成主要还是单药集群（图1b），这说明药物对转录组的特异性影响超过剂量、时间或毒性依赖性影响。其中的两个集群（包含三个TKIs，即阿法替尼、波那替尼和索拉非尼）具有内质网应激（ER stress）相关基因表达的顶级富集途径。我们将该结果在新生大鼠心室肌细胞（Neonatal rat cardiomyocytes, NRCMs）中进行了验证。所有三种TKI均在大鼠原代心肌细胞中诱导出现ER stress激活，并且NRCMs在接受7天波那替尼药物处理后，ER stress下游的IRE1α-XBP1s轴被显著激活。

图1.TKIs药物处理hiPSC-CM后，基于tSNE分析得到的转录组变化集群。

氧化应激能够诱导ER stress，因此我们还通过流式细胞学的方法评估了TKIs是否诱导NRCM中的活性氧物质（reactive oxygen species, ROS）。结果显示阿法替尼、索拉非尼和波那替尼这三种TKIs增加了心肌细胞的ROS水平：在药物处理3小时后，ROS高表达细胞的比例明显增加。在药物处理24小时后，三种TKIs均导致明显的脂质过氧化。另外在NRVM中我们观察到索拉非尼导致显著的钙离子超载，而钙超载能够打破心肌细胞内质网的稳态、影响心肌的收缩和舒张功能。这些TKIs的毒性也与心肌细胞的肌钙蛋白T表达降低有关，因此可能对心肌细胞收缩产生负面影响。

为了进一步验证TKIs在动物体内诱导的ER stress及其心脏毒性，我们用心脏毒性较高的波那替尼（15mg/kg）和索拉非尼（50mg/kg）对SD大鼠进行灌胃，建立了心脏毒性动物模型。在大鼠灌胃3天或7天后，收集心脏检测相关心肌损伤的指标。波那替尼诱导心房钠尿肽 (atrial natriuretic peptide, Anp）基因表达显著增加，Anp是一种在心脏应激或功能障碍期间重新表达的胎儿基因，因此能够表明该药物诱导了潜在的心脏毒性。Dnajb9是XBP1s的下游基因，波那替尼诱导其在第7天表达显著增加，再次表明了ER stress的XBP1s轴激活。索拉非尼在灌胃中并未显示出ER stress的明显激活，其原因需要进一步研究。

内质网应激可通过三种效应通路（PERK-ATF4、IRE1α-XBP1s或ATF6）中的一种或多种途径诱导细胞凋亡或炎症，从而导致心脏损伤。为了评估内质网应激下的哪些信号通路在TKI诱导的心肌细胞损伤中发挥重要作用，我们分别用三种TKIs和选择性抑制剂处理NRCM，然后检测其基因表达和细胞活力。ISRIB用于抑制PERK-ATF4信号传导，4μ8c抑制IRE1α-XBP1s轴。为了验证这些抑制剂的作用，我们分别测量了Atf4及其靶标Ddit3、Xbp1s及其靶标Dnajb9的表达。与这些药物的特异性一致，ISRIB显著抑制Atf4和Ddit3，而不太影响XBP1s轴，同时4μ8c抑制Xbp1s和Dnajb9而不影响ATF4轴。在细胞死亡方面，阿法替尼和波那替尼处理NRCM 24小时治疗后诱导的细胞死亡很少，但索拉非尼诱导了大量细胞死亡。4μ8c显著挽救了索拉非尼诱导的心肌细胞死亡，但PERK轴的抑制没有这种作用。初步数据表明，阿法替尼和波那替尼诱导的ER stress下游效应物均与细胞死亡无关，但索拉非尼诱导的心肌细胞死亡可能依赖IRE1α-XBP1s的激活。

此外，我们探讨了3种TKI是否激活了NRCM中ER stress下游的炎症。结果显示，炎症相关基因，如Nfkb1、Il-6、Tnf、Txnip和Il1b，在3个TKI处理24小时后均显著增加。心脏胎儿基因（如Anp、Bnp/Nppb和Myh6）也在TKI处理后增加，而所有这些炎症基因以及心脏胎儿基因的表达，均会被ISRIB和 4μ8c4所抑制（图2）。从而进一步证实了阿法替尼、索拉非尼和波那替尼通过PERK-ATF4和IRE1α-XBP1s信号通路引起心脏胎儿基因的再表达，并增加促炎基因的表达。

图2. 3种TKI通过PERK和IRE1α通路的协同激活导致胎儿基因和促炎基因表达增加。

总之，我们的转录组学研究数据包含了关于人类心肌细胞对8种TKIs的表型变化和转录反应的丰富信息，为寻找TKI相关的心脏毒性发生机制提供了重要线索，随后结合NRVM和大鼠动物实验，部分揭示了TKI类药物，尤其是索拉非尼和波那替尼导致心脏毒性的重要分子机制，即内质网应激及其诱导的炎症反应（图3）。心肌细胞中内质网的稳态非常重要，ER stress可被多种TKIs激活，并通过增加促炎因子和心脏胎儿基因的表达而导致心脏毒性。我们的研究也提示hiPSC-CMs可作为较好的细胞模型，为靶向药物相关心脏毒性的研究提供帮助，包括毒性的预测和治疗靶点的筛选。内质网应激及其诱导的炎症反应信号通路，是一个有潜在希望的治疗靶点，可能减轻由波那替尼和索拉非尼导致的心脏毒性。我们的研究也为后续的肿瘤心脏病学及其转化研究提供了重要思路。

图3. 阿法替尼（ATB）、索拉非尼（SFB）和波纳替尼（PTB）导致心脏毒性的机制示意图。

03专家评论

唐小强，四川大学华西第二医院副研究员/博士生导师， BMC Medicine编委：

抗肿瘤药物诱导的心脏毒性已日益成为临床关注的一个焦点问题，而其发病机制仍然需要更深入和系统的研究。在本研究中，王欢教授结合系统生物学和人干细胞来源心肌细胞，证明了内质网应激是多种心肌毒性抗肿瘤药物导致心肌细胞损伤共有的关键机制，提示干预内质网应激可作为减少肿瘤化疗引起的心肌毒性的重要手段。通过对多剂量多时间点TKIs处理人心肌细胞的高通量测序，作者发现药物引起的心肌细胞转录组变化更加受到药物的理化特征而非处理剂量或时间而调控，而这些转录组的数据中包含了心肌细胞对不同药物刺激的不同的代偿性反应。其中三种TKI都会诱导内质网应激的激活。这三种TKI主要通过内质网应激下游的PERK与IRE1α通路而激活IL1β与IL6的表达，而这些炎症因子都是增加心血管疾病的风险因素。这项研究的发现在前期工作Imatinib诱导的心脏毒性伴随内质网结构异常和内质网应激激活的基础上，更加细致地阐明了内质网应激下游通路造成心肌细胞损伤的作用机制。后期如果可以在荷瘤动物中评估三种TKI对心肌细胞损伤和内质网应激的影响将提升本研究的临床转化意义。此外，内质网应激是TKI抗肿瘤的重要机制，将来的研究仍然需要评估内质网应激是否可以作为减少TKI心脏毒性的靶点。总之，该研究发现了TKI导致心肌细胞毒性的新机制，为肿瘤心脏病学研究提供了重要的新思路，具有重要的理论意义和潜在的转化价值。

肖晗，北京大学第三医院研究员：

心血管疾病和恶性肿瘤是导致人类死亡的主要原因。随着抗肿瘤治疗的发展，许多患者因治疗出现了心血管系统损害，这是肿瘤学家和心血管专家面临的共同问题，并由此产生了肿瘤心脏病学，旨在研究与肿瘤相关心血管疾病的危险因素、机制、预防和干预。其中，抗肿瘤治疗过程中所产生的心脏毒性（Cardiotoxicity）的机制是本领域的研究重点，也是临床亟待解决的问题。本研究分析了肿瘤治疗领域中常用的靶向药物——TKIs，选取了8种TKIs作为研究对象，将这些药物按照不同剂量强度和作用时间，分别处理人诱导多能干细胞分化的心肌细胞，然后对TKI导致的细胞表型和转录组变化进行生物信息学分析。发现内质网应激ER stress可被多种TKIs激活，尤其是心脏毒性高风险的索拉非尼和波那替尼。利用乳鼠心肌细胞和大鼠动物实验，证实了索拉非尼和波那替尼通过PERK-ATF4和IRE1α-XBP1s信号通路引起心脏胚胎基因的再表达，并增加促炎基因的表达。本研究阐释了索拉非尼和波那替尼导致心脏毒性作用的分子机制，并提供了潜在的干预策略。

Bmc Medicine上刊登的本文：

https://bmcmedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12916-023-02838-2

图文排版：三度医学 Wally

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