阅读量：

36

作者：

周政

展开

摘要：

目的:1.建立心脏压力负荷心力衰竭(HF)模型,探讨miR-214/221,内质网应激,自噬的在HF中的作用.2.探讨益气温阳活血利水法防治HF的作用,并阐述其调节miR-214/221-内质网应激-自噬防治HF的机制.方法:1.miR-214/221-内质网应激-自噬轴在HF中的作用将C57BL/6J野生型小鼠随机分为六组,假手术(Sham)组,心衰(HF)组,心衰+抑制miR-214(HF+anti-miR214)组,心衰+抑制 mmiR-221(HF+anti-miR221)组,心衰+4-PBA(HF+4-PBA)组,心衰+3-MA(HF+3-MA)组.术后给予尾静脉注射慢病毒miR-214,miR-221转染心肌细胞抑制miR-214,miR-221.术后连续灌胃4周,其中3-MA(15mg/kg/天),4-PBA(100mg/kg/天)以分别抑制自噬,内质网应激,其余各组给予等体积的纯水,4周后对相关指标进行检测.(1)HF时miR-214/221,内质网应激,自噬的变化通过qPCR检测miR-214/221的表达水平;对组织进行匀浆,通过western blotting(WB),检测内质网应激相关蛋白XBP1,XBPls,自噬相关蛋白LC3B,Beclin-1,BNIP3,LAMP1的表达水平;使用免疫组化染色检测内质网应激蛋白GRP78阳性表达及自噬相关蛋白LC3B的阳性表达;使用透射电镜观察自噬小体的变化.(2)抑制内质网应激对HF中自噬及心功能影响使用心脏彩超检测小鼠心功能评价各组小鼠心功能的情况;通过HE染色观察心肌横截面积大小,对各组心肌肥大指标进行评价;通过MASSON染色显示纤维化病变区域,评价心肌纤维化的水平.通过TUNEL染色,对发生凋亡的心肌细胞进行检测.WB检测自噬相关蛋白LC3B,Beclin-1,BNIP3,LAMP1的表达水平.使用免疫组化染色检测自噬相关蛋白LC3B的阳性表达.使用透射电镜观察自噬小体的变化.(3)分别抑制miR-214,抑制miR-221对HF中的内质网应激-自噬轴及心功能的影响通过qPCR检测miR-214/221的表达水平.使用心脏彩超检测小鼠心功能评价各组小鼠心功能的情况;通过HE染色观察心肌横截面积大小,对各组心肌肥大指标进行评价;通过MASSON染色显示纤维化病变区域,评价心肌纤维化的水平.通过TUNEL染色,对发生凋亡的心肌细胞进行检测.WB检测内质网应激相关蛋白XBP1,XBPls,自噬相关蛋白LC3B Ⅱ/Ⅰ,Beclin-1,BNIP3,LAMP1的表达水平;免疫组化染色检测内质网应激蛋白GRP78,自噬相关蛋白LC3B的阳性表达.使用透射电镜观察自噬小体的变化.2.益气温阳活血利水法对HF中miR-214/221-内质网应激-自噬轴的调节作用将C57BL/6J小鼠随机分为六组,假手术(Sham)组,模型(HF)组,心阳片低剂量(XYP(340mg/kg)组,心阳片中剂量(XYP(680mg/kg)组,心阳片高剂量(XYP(1360mg/kg)组,培哚普利(Perindopril)组,连续灌胃给药6周.6周后对相关指标进行检测.(1)益气温阳活血利水法对HF的心功能,心肌细胞肥大与纤维化,心肌细胞凋亡的作用.使用心脏彩超观察各组小鼠心功能,通过HE染色观察心肌横截面积大小,对各组心肌肥大指标进行评价.通过MASSON染色显示纤维化病变区域,评价心肌纤维化的水平.通过TUNEL染色,对发生凋亡的心肌细胞进行检测.(2)探讨益气温阳活血利水法防治心衰的机制通过qPCR检测各组miR-214/221的表达水平.对各组组织进行匀浆,通过western blotting,检测内质网应激相关蛋白XBPl,XBP1s,自噬相关蛋白LC3B Ⅱ/Ⅰ,Beclin-l,BNIP3,LAMP1的表达水平.结果:1.miR-214/221-内质网应激-自噬轴在心衰中的作用(1)HF时miR-214/221,内质网应激,自噬的变化与 Sham 组相比,HF 的 LVEF,LVFS 均显著下降,LVIDd,LVIDs,LVEDV,LVESV,LVmass显著上升(P0.05),HF组单个心肌细胞相对面积显著增加,心肌纤维化相对面积显著增加(P0.05),HF组的心肌细胞凋亡程度显著增加.与Sham组相比,HF组的内质网应激相关蛋白表达,自噬相关蛋白表达与miR-214/221的表达均显著增加(P0.05).(2)内质网应激-自噬轴在HF中的作用心脏彩超结果显示,与HF组相比,HF+4-PBA组,HF+3-MA组的心功能显著改善(P0.05).HE染色结果显示,HF+4-PBA组,HF+3-MA组的单个心肌细胞相对面积显著降低(P0.05).MASSON染色结果显示,与HF组相比,HF+4-PBA组,HF+3-MA组相对心肌纤维化面积显著降低(P0.05).TUNEL染色结果显示,与HF组相比,HF+4-PBA组,HF+3-MA组凋亡的心肌细胞减少.WB结果显示,与HF组相比,HF+4-PBA组心肌组织自噬相关蛋白LC3B,Beclinl,BNIP3,LAMP1表达显著减少(P0.05).免疫组化染色结果显示,与HF组相比,HF+4-PBA组的LC3B阳性表达区域也减少.电镜结果也显示,与HF组相比,抑制内质网应激能够减少自噬小体的数量.(3)miR-214/221对HF中内质网应激-自噬轴及心功能,心室重构的影响心脏彩超,HE染色,MASSON染色,TUNEL染色结果显示,与HF组相比,HF+anti-miR214组,HF+anti-mi R-221组的心功能,心肌细胞肥大与心肌纤维化显著改善(P0.05),凋亡心肌细胞减少.WB结果显示,与HF组相比,HF+anti-miR214组,HF+anti-miR-221组的心肌组织内质网应激相关蛋白XBP1,XBPIS显著减少,自噬相关蛋白LC3B,Beclinl,BNIP3,LAMP1表达显著减少(P0.05).免疫组化染色结果显示,与HF组相比,HF+anti-miR214组,HF+anti-miR-221组内质网应激相关蛋白GRP78,自噬相关蛋白LC3B阳性表达区域也减少.电镜结果也显示,与HF组相比,HF+anti-miR214组,HF+anti-miR-221组的自噬小体数量减少.2.益气温阳活血利水法对HF中miR-214/221-内质网应激-自噬轴的调控作用.结果显示,与HF组相比,心阳片低,中,高剂量组,培哚普利组的心功能,心肌细胞肥大,心肌纤维化,心肌细胞凋亡改善(P0.05).心阳片低,中,高剂量组及培哚普利组分别能有效抑制内质网应激相关蛋白的表达,也能有效抑制自噬相关蛋白的表达并使miR-214,miR221的表达下降(P0.05).结论:1.MiR-214/221-内质网应激-自噬轴在HF中发挥了重要作用,抑制miR-214/221-内质网应激-自噬轴可改善HF的心功能,心室重构.2.益气温阳活血利水法能通过抑制miR-214/221及内质网应激介导的过度自噬,有效防治压力负荷导致的HF.

展开