GRP78 BiP (HSPA5)靶点介绍及实验小贴士

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GRP78 BiP (HSPA5)靶点介绍及实验小贴士

2024-07-13 21:01:08| 来源: 网络整理| 查看: 265

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图一:GRP78 BiP靶点蛋白结构。图片来源:SWISS-MODEL。GRP78 BiP靶点介绍蛋白功能蛋白特性蛋白定位异构体 & 翻译后修饰

​WB实验贴士注意事项阳性对照结果示例关键控制点参考文献

GRP78 BiP靶点介绍蛋白功能

   可能在促进内质网上的多聚蛋白复合物的组装中起作用。

   通过与DNAJC10的相互作用,参与蛋白质的正确折叠,同时,可能是为了促进DNAJC10从底物中释放出来,  还会参与错误折叠蛋白的降解过程。

蛋白特性

   类风湿性关节炎的自身抗原。

蛋白定位

   GRP78 BiP定位于细胞质,内质网腔,黑素体,细胞表面。

图二:GRP78 BiP ICC实验结果图,Anti- GRP78 BiP 抗体 [EPR21226] (ab213258)。HeLa细胞用5ug/ml Brefeldin A处理细胞30 min。绿色:GRP78 BiP,红色:Tubulin,蓝色:DAPI。异构体 & 翻译后修饰

   人(P11021):72kDa(预测)

   小鼠(P20029):72kDa(预测)

   大鼠(P06761):72kDa(预测)

   存在乙酰化,磷酸化修饰等

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WB实验贴士注意事项

   GRP78 BiP蛋白在不同细胞系和组织之间的表达量存在差异;使用Tunicamycin处理会提高部分细胞中检测到的蛋白信号强度,如HeLa, MCF, MEF, HUVEC, Raw 264.7等。所以,建议内源表达较低的细胞样本尝试使用Tunicamycin处理。

阳性对照

   细胞系:HeLa、 HepG2细胞裂解液。

   组织:小鼠、大鼠肝脏裂解液。

结果示例

图三:WB-Anti-GRP78 BiP 抗体[EPR4041(2)] (ab108615)。泳道1:15 µg HeLa全细胞裂解液泳道2:15 µg 10µg/ml衣霉素处理12h 的HeLa全细胞裂解液泳道3:15 µg MCF-7全细胞裂解液泳道4:15 µg 10µg/ml衣霉素处理48h 的MCF-7全细胞裂解液泳道5:15 µg MEF全细胞裂解液泳道6:15 µg 10µg/ml衣霉素处理48h 的MEF全细胞裂解液一抗:Anti-GRP78 BiP 抗体[EPR4041(2)] (ab108615),浓度 1/1000 稀释。二抗:HRP标记的山羊抗兔二抗(ab97051),浓度 1/20000 稀释。预测条带大小:72 kDa

关键控制点

     在实验中除了需要注意常规问题外,还要特别关注以下关键控制点:

  样本制备

     添加复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。

     整个样本制备过程中,保持样本置于冰上。

     通过Bradford分析、Lowry分析或BCA分析测定样本总蛋白浓度。

   电泳

     建议使用阳性对照。

   转膜

     建议转膜完成后使用丽春红染色,确定转膜是否成功。

   抗体孵育

     请根据产品说明书选择合适的抗体工作浓度。

回到顶部参考文献Wan-Chi Lin, Yu-Chi Chuang, Yung-Sheng Chang, Ming-Derg Lai, Yen-Ni Teng, Ih-Jen Su, Clay C C Wang, Kuan-Han Lee, Jui-Hsiang Hung. Endoplasmic reticulum stress stimulates p53 expression through NF-κB activation. PLoS One. 2012;7(7):e39120. doi: 10.1371/journal.pone.0039120. Epub 2012 Jul 30.Jie Wang, Jessica Lee, David Liem, Peipei Ping. HSPA5 Gene encoding Hsp70 chaperone BiP in the endoplasmic reticulum. Gene. 2017 Jun 30;618:14-23. doi: 10.1016/j.gene.2017.03.005. Epub 2017 Mar 7.D T Ng, S S Watowich, R A Lamb. Analysis in vivo of GRP78-BiP/substrate interactions and their role in induction of the GRP78-BiP gene. Mol Biol Cell. 1992 Feb;3(2):143-55. doi: 10.1091/mbc.3.2.143.



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